煤工塵肺合并晚期肺腺癌驅動基因突變與臨床病理特征的關系

張建紅，李 瑤，石金鳳，溫正軍

（北京京煤集團總醫院呼吸與危重癥醫學科，北京 102300）

煤工塵肺是我國最常見的職業病，隨著病情的發展，癥狀會越來越嚴重，部分患者還會出現呼吸減弱、呼吸困難等癥狀。研究認為，煤工塵肺并發肺腺癌的風險更高，對患者的身心健康造成嚴重的影響，且煤工塵肺合并晚期肺腺癌患者臨床癥狀容易被原發病掩蓋，導致治療難度增加[1]。目前，化療是治療煤工塵肺合并晚期肺腺癌主要手段之一，而其對患者的身體狀況具有較高的要求，且經常伴有不良反應。分子靶向藥物是在細胞分子水平上，針對已經明確的致癌位點，來設計相應的治療藥物，藥物進入體內會特異性地選擇致癌點來結合發生作用，使腫瘤細胞特異性死亡。近年來，研究發現分子靶向藥物特異性高、不良反應小，對多種惡性腫瘤具有顯著療效[2]。本研究旨在探討煤工塵肺合并晚期肺腺癌驅動基因突變，并分析其與臨床病理特征的關系，為患者靶向治療方案提供參照，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇北京京煤集團總醫院2014年1月至2020年1月救治的70例煤工塵肺合并晚期肺腺癌患者，并開展前瞻性研究。患者均為男性，年齡44～91歲，平均（71.43±10.89）歲；接塵時間4～35年，平均（20.87±7.40）年；無吸煙史9例，吸煙史61例；塵肺期別[3]：Ⅰ期15例，Ⅱ期50例，Ⅲ期5例；分化程度：低分化24例，中分化28例，高分化18例。納入標準：年齡≥ 18歲者；既往經職業病鑒定機構診斷為煤工塵肺者；經病理確診為原發性肺腺癌者；配合完善基因檢測者。排除標準：臨床資料不全者；合并心、腎等重要器官損傷者；中途退出者。本研究已經院內醫學倫理委員會批準，且患者及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 組織DNA和RNA的提取 用刀片切取3張5 μm厚患者的石蠟包埋肺組織樣本，放置1.5 mL EP管內，二甲苯脫蠟后，用甲醇固定包埋組織樣本，并提取DNA與細胞總RNA，DNA和RNA分離后，用Nanodrop 2 000測定DNA和RNA的濃度。

1.2.2 蝎形探針擴增阻滯突變系統（ARMS）熒光定量PCR法 應用廈門艾德生物公司生產的測試試劑盒，依照試劑盒說明書操作。PCR反應條件：42 ℃ 5 min，1個循環為第一階段；95 ℃ 25 s，64 ℃ 、72 ℃各 20 s，10 個循環為第二階段；93 ℃ 25 s，60 ℃、72 ℃各 20 s，36 個循環為第三階段。均于第三階段60 ℃時提取FAM與HEX信號，執行PCR。

1.2.3 二代測序技術（NGS） 應用艾德生物公司的人類癌癥多基因突變與檢測試劑盒聯合，依照試劑盒說明書操作。陽性判定值[4]：平均原始深度＞10 000×，平均有效深度＞ 500×，突變比例不低于0.4%，突變絕對拷貝數不低于2，鏈平衡性介于0.1～10之間，同時滿足以上條件時為陽性（基因突變）；沒有發生基因突變的為陰性。

1.3 觀察指標 整理全部患者的病例資料，包括平均年齡、吸煙史、平均接塵時間、塵肺期別、分化程度等。①分析EGFR基因突變與臨床、病理特征的關系。②分析KRAS基因突變與臨床、病理特征的關系。③分析TP53基因突變與臨床、病理特征的關系。

1.4 統計學分析 運用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗；計數資料以[ 例(%)]表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR基因突變與臨床、病理特征的分析 70例患者中，EGFR基因突變率為11.43%(8/70)。陽性與陰性組患者平均年齡、接塵時間、塵肺級別、分化程度比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05)；陽性組無吸煙的患者占比顯著高于陰性組，吸煙的患者占比顯著低于陰性組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 KRAS基因突變與臨床、病理特征的分析 KRAS基因突變率為21.43%（15/70）。陽性與陰性組患者平均年齡、吸煙、接塵時間、塵肺級別比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05)；陽性組低分化程度的患者占比顯著高于陰性組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 KRAS基因突變與臨床、病理特征的關系

2.3 TP53基因突變與臨床、病理特征的分析 TP53基因突變率為48.57%（34/70）。陽性與陰性組患者平均年齡、吸煙、平均接塵時間、塵肺期別、分化程度比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05)，見表3。

表3 TP53基因突變與臨床、病理特征的關系

3 討論

煤工塵肺是嚴重危害煤礦工人健康的一種職業病，容易與多種并發癥同時發生，其中合并肺腺癌死亡率較高。近年來有報道，煤工塵肺患者合并肺腺癌的發生率明顯高于普通人群，嚴重威脅患者生命健康與生活質量，化療為其常用治療方法，但臨床效果欠佳。分子靶向藥物利用腫瘤細胞與正常細胞之間分子生物學上的差異（包括基因、酶、信號轉導等不同特性），抑制腫瘤細胞的生長增殖，最后使其死亡，相比于目前的化療更加有效，不良反應少，屬于一種更為安全的腫瘤治療方法[5]。因此，探討煤工塵肺合并晚期肺腺癌患者肺癌驅動基因突變與臨床病理特征之間的關系，對后期臨床治療意義重大。

本研究發現EGFR基因突變的陽性率達11.43%，且主要集中在21外顯子L858R、19外顯子缺失。針對EGFR基因突變的靶向治療是晚期肺腺癌最重要的治療之一，只有EGFR基因突變的患者才能從靶向治療中獲益，因此，進一步證明了煤工塵肺合并晚期肺腺癌靶向治療具有較高的難度[6]。本研究中煤工塵肺合并晚期肺腺癌患者EGFR 基因突變的陽性率較低，可能與塵肺病一定程度抑制EGFR的突變有關。本研究對驅動基因突變與臨床病理特征的關系中發現，EGFR基因突變在平均年齡、塵肺級別、組織學類型、分化程度上，差異均無統計學意義，在吸煙上差異有統計學意義。有研究結果發現，EGFR基因突變與性別、吸煙情況存在顯著相關關系，而與年齡無顯著相關，且EGFR基因突變后的病理分析主要為腺泡型，其次為貼壁型[7]。還有研究人員進一步對EGFR基因突變的病例標本進行檢測，EGFR不同位點的突變其病理類型也有不同，例如19外顯子突變在乳頭型中較高，其次為貼壁型；而21外顯子突變為貼壁型中較高，其次為乳頭型和實體型[8]。對于肺腺癌亞型與EGFR基因突變之間的關系在不同研究結果中并不一致，但是能肯定是EGFR基因的突變與病理類型之間仍存在一定聯系。

KRAS基因突變多見于肺腺癌，鱗癌較少見，本研究中，KRAS基因突變率為21.43%,高于既往研究[9]報道。而KRAS基因突變在患者的分化程度上，差異有統計學意義，說明KRAS基因突變與低級別腺瘤向高級別腺瘤、癌變的多步驟演變過程相關。有研究報道，KRAS基因突變在男性患者中的突變率顯著高于女性，在腺癌中的突變率顯著高于非腺癌,在吸煙患者中的突變率顯著高于不吸煙者，EGFR、KRAS突變與患者年齡、有無淋巴結轉移無相關性[10]。這與本研究具有一定的差異，分析原因可能是基因的檢測方法不同導致陽性率有偏差，而且陽性樣本量普遍偏少致使結論不一。

TP53是一種抑癌基因，發生突變后，逐漸喪失對細胞生長、凋亡及 DNA 的修復能力，可由抑癌基因轉變為促癌基因，影響患者的生存期，為常見突變，存在于近乎或者超過一半的非小細胞肺癌患者中，本研究結果顯示，TP53基因突變率為48.57%，研究顯示，TP53是目前已知人類腫瘤中突變率最高的基因，當TP53基因發生突變時，所表達的突變的P53蛋白喪失了正常功能[11]。喪失功能的P53蛋白會加速腫瘤的發生和進展，同時為腫瘤的侵襲及其轉移創造條件。分析TP53患者基因突變情況與其臨床病理特征結果對比，TP53突變在年齡、吸煙、接塵時間、塵肺級別、分化程度上，差異均無統計學意義。有研究報道，TP53突變與年齡具有顯著性差異，而與性別、TNM分期、吸煙史、淋巴結轉移、取材部位及腫瘤分化程度無顯著相關性[12]。這與本研究結果類似，年齡具有一定差異的原因可能是該研究納入樣本量較少，與研究報道中的年齡選取存在一定差異性。

綜上，煤工塵肺合并晚期肺腺癌患者肺癌驅動基因突變與臨床病理特征之間的關系密切，吸煙和癌細胞分化程度與驅動基因陽性突變率有著密切聯系。然而本研究的不足之處在于患者入組病例數量少，可能導致結論存在偏倚。