銀屑靈片對尋常型銀屑病血瘀證患者外周血單核細胞差異表達基因和miRNA芯片結(jié)果關聯(lián)分析※

盧 月 亓 垚 陳曲波 韓 凌 郜恒駿 盧傳堅

(廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院廣東省中醫(yī)證候臨床研究重點實驗室，廣東 廣州 510006)

尋常型銀屑病是由多種遺傳基因決定的、多環(huán)境因素刺激誘導的慢性增生免疫異常性皮膚病，發(fā)病率占世界人口的2%～3%[1-2]。有研究認為，微血管生成異常與銀屑病的發(fā)生、持續(xù)存在及復發(fā)關系密切，在尋常型銀屑病的發(fā)病機制中起重要作用[3]。

中醫(yī)學稱尋常型銀屑病為“白疕”，中醫(yī)治療尋常型銀屑病的優(yōu)勢在于緩解期長，病情穩(wěn)定，不易反彈，毒副作用少[4]。我們前期通過對尋常型銀屑病中醫(yī)基本證候與疾病分期及病情的相關性進行探討，發(fā)現(xiàn)尋常型銀屑病患者中醫(yī)基本證候分布依次為血瘀證(70.3%)>血燥證(17.3%)>熱證(12.4%)，且血瘀證與穩(wěn)定期相關[5]。研究表明，尋常型銀屑病患者存在明顯的微循環(huán)障礙和血液流變學變化，組織病理檢查中可見毛細血管異常，包括血管扭曲、血管通透性明顯升高等表現(xiàn)[6-8]。銀屑靈片由赤芍、莪術(shù)、腫節(jié)風、土茯苓、烏梅、紫草、當歸、熟地黃、牡丹皮和甘草組成，為廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院制劑，制劑號Z20080123，治療尋常型銀屑病療效確切，且安全性好[9]。

通過基因表達譜芯片和miRNA芯片技術(shù)，對銀屑靈片治療尋常型銀屑病血瘀證患者前后的外周血單核細胞(PBMC)基因表達水平和miRNA表達水平進行分析，對差異表達基因和miRNA進行關聯(lián)分析，從基因和miRNA水平揭示銀屑靈片治療尋常型銀屑病血瘀證的微觀物質(zhì)基礎。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

1.1.1 診斷標準 西醫(yī)診斷符合尋常型銀屑病的診斷[10]，中醫(yī)證型診斷符合白疕血瘀證診斷[3]。且3分<銀屑病皮損面積及嚴重程度指數(shù)(PASI)評分<30分，體表受累面積(BSA)<30%。

1.1.2 納入標準 本研究所有與人體相關的研究內(nèi)容均遵循赫爾辛基宣言和中國有關臨床試驗研究規(guī)范、法規(guī)，所有納入研究的研究對象均簽署知情同意書，標本采集前由研究人員介紹本研究的目的和治療。

1.1.3 排除標準 妊娠期或哺乳期婦女；近6個月內(nèi)服用過類固醇藥物或維甲酸類藥物，或用過生物制劑；1個月內(nèi)外用過類固醇制劑或維甲酸類乳膏；合并甲狀腺功能亢進，心腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾病，精神病，長期服藥患者；多種中醫(yī)證型夾雜患者。

1.2 一般資料 選取2016-04—2016-07廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院皮膚科門診尋常型銀屑病血瘀證患者9例為銀屑靈片組，均為穩(wěn)定期[10]。男5例，女4例；年齡最大61歲，最小21歲，平均(42.26±11.24)歲；病程最長40年，最短7個月，平均(15.3±10.0)年；PASI評分 3.3～13.6分；瘙癢視覺模擬評分(VAS)0～7.6分。同時選取廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院體檢中心門診體檢的健康者9人為健康組，男5人，女4人；年齡最大65歲，最小17歲，平均(39.52±10.31)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.3 治療方法 2組均予適當?shù)纳钪笇В撑Ｑ蛉狻⒑ｕr、芒果、榴蓮等易致敏食物；規(guī)律作息，心情舒暢，戒煙限酒，適當運動，避免感染。

1.3.1 銀屑靈片組 予銀屑靈片5 片，每日三餐后口服，連服12 周。

1.3.2 健康組 不予任何治療。

1.4 儀器及試劑 TRI Reagent(德國Sigma公司)；miRNeasy Micro 試劑盒(德國QIAGEN公司)；RNase-Free DNase Set(德國QIAGEN公司)；Affymetrix表達譜配套試劑盒GeneChip?WT PLUS 試劑盒(美國Affymetrix公司)；GeneChip?雜交洗脫染色試劑盒(美國Affymetrix公司)；滾動雜交爐(美國Affymetrix公司)；基因芯片洗滌工作站(美國 Affymetrix公司)；Agilent Bioanalyzer 2100電泳儀(美國Agilent公司)；芯片掃描儀GeneChip?Scanner 3000DX2(美國Affymetrix公司)；GeneChip?clariom D 基因芯片、Agilent Human miRNA,Release 21.0(8×60K,Design ID:070156)芯片(美國Affymertix 公司)；NanoDrop ND-2000超微量分光光度計(美國Thermo Scientific公司)；數(shù)據(jù)采集Command Console Software 3.1軟件、數(shù)據(jù)分析Transcriptome Analysis Console Software軟件(美國Affymetrix公司)。

1.5 標本采集及處理 采集研究對象肘靜脈血10 mL于含有肝素的抗凝管中，按照試劑盒說明書分離外周血PBMC，置-80℃冰箱保存。銀屑靈片組治療前后各抽血1次，健康組僅試驗開始時抽血1次。

1.6 RNA的抽提與質(zhì)檢 根據(jù)Sigma提供的標準操作流程,采用TRI Reagent對樣本總RNA進行抽提，進而使用miRNeasy Micro試劑盒和RNase-Free DNase Set純化總RNA。在質(zhì)檢評斷合格后，純化后的總RNA，經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100電泳儀評估RNA的完整性。

1.7 基因芯片實驗 本實驗采用Affymetrix表達譜配套試劑盒GeneChip?WT PLUS 試劑盒，按照生產(chǎn)廠家規(guī)定的標準操作流程對樣品總 RNA中的mRNA進行體外反轉(zhuǎn)錄擴增，同時用生物素標記cRNA。

按照Affymetrix芯片雜交流程，將生物素標記的cRNA加入盒式芯片中，按照表達譜芯片配套提供的雜交標準流程使用配套試劑盒，在45 ℃滾動雜交爐中滾動雜交16 h，雜交完成后使用GeneChip?雜交洗脫染色試劑盒在基因芯片洗滌工作站按照標準操作流程進行芯片洗滌。

芯片結(jié)果采用芯片掃描儀GeneChip?Scanner 3000DX2進行掃描，用Command Console Software 3.1 軟件讀取原始數(shù)據(jù)，質(zhì)控合格的數(shù)據(jù)采用Command Console Software 3.1軟件進行歸一化處理，使用Gene level-SST-RMA算法對數(shù)據(jù)進行質(zhì)控并出具數(shù)據(jù)報告，采用Transcriptome Analysis Console軟件進行初步的基因差異表達分析。篩選P<0.05，倍性變化(fold change)≥2的差異基因，利用DAVID在線數(shù)據(jù)庫進行富集，選擇P<0.05的通路進行分析。

1.8 miRNA芯片實驗 本研究使用的芯片為Agilent Human miRNA ,Release 21.0(8×60K,Design ID:070156)芯片，樣品總RNA利用NanoDrop ND-2000超微量分光光度計定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100電泳儀檢測RNA完整性。RNA質(zhì)檢合格后，參照芯片標準流程進行樣本的標記、芯片的雜交及洗脫，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C掃描得到原始圖像。采用Feature Extraction 10.7.1.1軟件處理原始圖像提取原始數(shù)據(jù)。接著利用Genespring 13.1軟件進行標準化和后續(xù)處理。篩選P<0.05，倍性變化(fold change)≥2的上調(diào)或下調(diào)差異miRNA。然后利用3個數(shù)據(jù)庫Targetscan在線數(shù)據(jù)庫、microRNAorg在線數(shù)據(jù)庫和pita在線數(shù)據(jù)庫共同對差異miRNA進行靶基因預測，接著對靶基因進行基因本體(Gene Ontology，GO)和代謝途徑(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，以判定差異miRNA主要影響的生物學功能或通路。根據(jù)表達譜芯片的差異基因分析結(jié)果，miRNA芯片差異miRNA及靶基因預測結(jié)果，利用DIANA在線工具及其數(shù)據(jù)庫對基因芯片和miRNA芯片結(jié)果進行關聯(lián)分析和維恩分析。

2 結(jié)果

2.1 銀屑靈片組治療前與健康組PBMC表達譜芯片與miRNA芯片結(jié)果關聯(lián)分析 根據(jù)銀屑靈片組治療前與健康組PBMC的miRNA芯片差異miRNA的靶基因預測結(jié)果，將表達譜分析的差異基因與miRNA芯片分析的差異miRNA按照差異改變負相關的關系進行關聯(lián)分析，并繪制了差異miRNA與相關聯(lián)的差異基因的網(wǎng)絡圖。結(jié)果表明，治療前尋常型銀屑病血瘀證患者與健康者PBMC的差異miRNA包括hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-362-3p、hsa-miR-374a-5p等共48個。尋常型銀屑病血瘀證患者與健康人PBMC的差異miRNA靶基因包括PIK3C2B、MSI2、RPS6KA1等共27個(見圖1)。

圖1 銀屑靈片組治療前與健康組PBMC差異miRNA與相關聯(lián)差異基因網(wǎng)絡圖

2.2 銀屑靈片組治療后與健康組PBMC表達譜芯片與miRNA芯片結(jié)果關聯(lián)分析 將銀屑靈片組治療后與健康組PBMC表達譜分析的差異基因與miRNA芯片分析的差異miRNA按照差異改變負相關的關系進行關聯(lián)分析。結(jié)果表明，治療后尋常型銀屑病血瘀證患者與健康者PBMC的差異miRNA包括hsa-miR-23c、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-486-5p等共47個。尋常型銀屑病血瘀證患者與健康者PBMC的差異miRNA靶基因包括HIVEP2、RAB39B、RBMS1等共33個(見圖2)。

圖2 銀屑靈片組治療后與健康組PBMC差異miRNA與相關聯(lián)差異基因網(wǎng)絡圖

2.3 銀屑靈片組治療前后PBMC表達譜芯片與miRNA芯片結(jié)果關聯(lián)分析 銀屑靈片組治療前后PBMC表達譜芯片與miRNA芯片結(jié)果關聯(lián)分析結(jié)果表明，治療前后PBMC的差異miRNA包括7個：hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-194-5p、hsa-miR-212-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-362-3p、hsa-miR-199b-5p，差異miRNA靶基因包括14個：MYADM、SLAM6、DYNLL2、PHF20L1、ZNF385A、ARID18、TJAP1、MLXIP、KLF13、NINL、BACH2、RBMS1、DDX5、SORL1(見圖3)。

圖3 銀屑靈片組治療前后PBMC差異miRNA與相關聯(lián)差異基因網(wǎng)絡圖

3 討論

本研究通過基因表達譜芯片和miRNA芯片技術(shù)，對銀屑靈片治療前后尋常型銀屑病血瘀證患者與健康者PBMC中差異表達的基因和miRNA進行分析，并將結(jié)果進行關聯(lián)。

尋常型銀屑病血瘀證患者與健康者PBMC芯片結(jié)果存在具有靶標關系的差異miRNA 48個和差異靶基因27個。尋常型銀屑病血瘀證可能是通過這些差異miRNA對靶基因進行調(diào)控，從而參與尋常型銀屑病血瘀證的發(fā)生和發(fā)展。有文獻報道，miR-148a-3p可靶向調(diào)控c-Jun mRNA表達，C-Jun調(diào)節(jié)炎癥相關基因的表達，并影響細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡[11]。miR-148b-3p可調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6和IL-8等促炎因子，影響核因子κB(NF-κB)信號通路[12]。miR-199b-5p通過PBMC中的糖原合成酶激酶3β(GSK3β)/NF-κB信號傳導途徑減弱了炎性反應[13]。microRNA-362-3p通過抑制Paired box基因2減輕神經(jīng)痛并減少細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和分裂原激活的蛋白激酶p38(p38 MAPK)的活化抑制神經(jīng)元炎癥[14]。心肌再灌注損傷常引起氧化應激和炎癥，miR-374a-5p可能對體內(nèi)心臟缺血/再灌注(I/R)損傷和體外缺氧/復氧(H/R)損傷具有保護作用[15]。miR-148a-3p、miR-148b-3p、miR-199b-5p、microRNA-362-3p和miR-374a-5p共有靶基因磷酸二酯酶4(PDE4)通過降解環(huán)磷酸腺苷(cAMP)發(fā)揮促炎作用，而PDE4抑制劑在體內(nèi)和體外均具有抗炎作用。有研究表明，與正常組比較，尋常型銀屑病患者PBMC中PDE4B和PDE4D mRNA過度表達，真皮中PDE4表達上調(diào)[16]。miR-148a-3p和miR-148b-3p共有靶基因雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶1B(DYRK1B)與T淋巴細胞中IL-2產(chǎn)生相關[17]。

本研究結(jié)果表明，銀屑靈片組治療前后PBMC芯片結(jié)果中有差異miRNA 7個和差異靶基因14個。有研究表明，miR-212-3p通過抑制SRY和轉(zhuǎn)錄因子5(SOX5)，可減少類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞(RA-FLS)增殖并促進細胞凋亡[18]。miR-31促進角質(zhì)形成細胞的增殖和遷移[19]，miR-31-5p的靶基因Bach2在調(diào)節(jié)輔助型T細胞2(Th2)分化和Ⅱ型免疫應答中發(fā)揮重要作用[20]。miR-31-5p的靶基因KLF13在多個階段參與B淋巴細胞和T淋巴細胞的發(fā)育，KLF13在CD21和CD23的共調(diào)節(jié)中具有負性調(diào)節(jié)作用，并參與T細胞抗原受體(TCR)、前B細胞受體(pre-BCR)和B細胞抗原受體(BCR)的信號傳遞[21]。因此，我們認為銀屑靈片通過調(diào)控這些差異表達的miRNA和靶基因發(fā)揮治療尋常型銀屑病血瘀證的作用。

綜上所述，本研究通過對銀屑靈片治療尋常型銀屑病血瘀證患者PBMC的表達譜芯片與miRNA芯片結(jié)果進行關聯(lián)分析，得到尋常型銀屑病血瘀證和銀屑靈片治療血瘀證的微觀物質(zhì)基礎，并且發(fā)現(xiàn)hsa-miR-146b-5p等7個miRNA及其靶基因DYNLL2等14個基因有可能是銀屑靈片治療尋常型銀屑病血瘀證的重要靶點，本結(jié)果還需動物和細胞實驗的進一步驗證。