界面組成對乳狀液穩定性及其緩釋消化的影響

張婧嫣，朱玲，吳港城，齊希光，張暉

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

肥胖不僅會帶來形體問題，更能引發心腦血管疾病、高血脂等慢性疾病風險[1]。引起肥胖的重要原因就是能量攝入過多，雖然通過減少食物中的油脂含量或是使用脂肪酶抑制劑降低油脂的可消化性均可減少能量攝入，但這些舉措也喪失了食用油脂帶來的積極作用，且大量未消化的油脂進入結腸不利于人體健康，需要權衡考量[2]。

近年來，一種利用飽腹感的飲食干預策略逐漸為大眾所接納[3]。“回腸剎車”機制被認為是一個可有效控制進食量的舉措，它是指當未吸收的消化產物(如三酰甘油水解釋放的游離脂肪酸)暴露的位置越靠近小腸的末端，它們誘導產生的飽腹感效應也就越強[4]。因脂肪酶水解油脂的作用位點只能在油滴表面，所以可通過在油滴界面結構上進行優化來延緩其在胃腸道中的消化速率[5]。

已知油脂在食品中多以乳狀液形式存在，而乳狀液的結構在油脂消化方面扮演重要角色[6]，如乳狀液在胃環境中的酸穩定性對于飽腹感激素的釋放有重要影響[7]。因此需要從界面設計入手來構建一種既能使油滴在胃環境中保持均勻分散和穩定、又能在小腸環境中緩慢消化的乳液體系。基于逐層靜電沉積技術構建的多層乳液可以通過改變其界面結構來干擾消化酶與油脂相互作用的能力。已有學者研究了果膠(pectin，PC)的性質與其抑制脂解之間的聯系[8]，且有國外學者發現，添加4%(質量分數)果膠的乳化脂肪相對于對照組，甘油三酯的體外消化降解程度減少了20%[9]；覃定奎[10]在初級乳液的基礎上添加多糖，發現當殼聚糖(chitosan，CS)和海藻酸鈉(sodium alginate，ALG)的質量分數增加至0.4%時可顯著抑制油脂消化；SILVA等[11]則利用動態體外模擬實驗評估了用殼聚糖和海藻酸鈉構建的多層乳液的油脂消化程度，發現這些聚電解質層的添加顯著降低了總游離脂肪酸的釋放量。然而，大多數研究中未對這些乳狀液的胃部酸穩定性進行鑒定分析，且體外消化模型不一，難以科學地對各結果進行對比。本研究選擇PC、ALG、CS作為多層乳液構建的界面材料，探討不同界面組成對乳狀液油滴在胃腸道中的消化特性的影響。這將有助于發展以多層乳液為核心的界面工程技術，有望為開發具有延緩油脂消化、提高飽腹感效果的功能性食品提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白(whey protein isolate，WPI)，美國希爾瑪公司；殼聚糖，海藻酸鈉，上海百靈威化學技術有限公司；亞麻籽油，中糧集團有限公司；胃蛋白酶，美國Sigma公司；果膠、胰脂肪酶、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸、氫氧化鈉、冰乙酸和用于體外模擬胃腸道消化的其他化學試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

M133/1 281-0高速剪切機，瑞士Biospec Products公司；M110L微射流均質機，美國Microfluidics公司；Zetasizer nano ZS納米粒度及Zeta電位儀，英國Malvern公司；Nano Brook Omni多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀，美國Brookhaven Instruments公司；ZQTY-50振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 初級乳液的制備

將WPI溶于5 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)和5 mmol/L醋酸緩沖液(pH 3.5)中制備具有不同pH值的WPI溶液。將PC和ALG分散到5 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中制備PC和ALG溶液，將CS分散到100 mmol/L醋酸緩沖液(pH 3.5)中制備CS溶液。

將亞麻籽油與2種WPI溶液混合，經10 000 r/min高速剪切5次，再用70 MPa高壓微射流均質機均質循環3次，得到2種初級乳液(W)，最終組成為質量分數分別為10%的亞麻籽油和1%的WPI(pH 7.0和pH 3.5)。

1.3.2 多層乳液的制備

在pH 7.0時，將初級乳液分別添加到PC和ALG溶液中，再調pH值至3.5，形成WPI-PC/ALG的亞麻籽油二級乳液(W-P/A)，最終組成為5%的亞麻籽油、0.5%的WPI和0.2%的PC或0.3%的ALG(均為質量分數)。在pH 3.5時，將初級乳液添加到CS溶液中，再調pH值至5.5，形成WPI-CS的亞麻籽油二級乳液(W-C)，最終組成為質量分數分別為5%的亞麻籽油、0.5%的WPI和0.15%的CS。在pH 3.5時，將W-P二級乳液添加到CS溶液中，產生的絮狀物用超聲破壞，形成WPI-PC-CS的亞麻籽油三級乳液(W-P-C)，最終組成為質量分數分別為2.5%的亞麻籽油、0.25%的WPI、0.1%的PC和0.2%的CS。各聚合物濃度均是通過優化試驗確定，即通過測定粒徑和Zeta電位，得出乳液被聚電解質完全包覆，且溶液中聚電解質沒有顯著過量的最佳濃度水平。

1.3.3 乳液的粒徑及其分布

用多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀測定乳狀液的平均粒徑、多分散指數(polydispersity index，PDI)與粒徑分布。在室溫下，將每種乳狀液搖勻后，用5 mmol/L適當pH值的緩沖液稀釋至相同的最終油濃度(質量分數為0.025%)，避免多重散射效應。

1.3.4 乳液的Zeta 電位

用納米粒度與Zeta電位儀測定乳狀液的Zeta電位。在室溫下，每種乳狀液均用5 mmol/L適當pH值的緩沖液稀釋至相同的最終油濃度(質量分數為0.025%)，避免多重散射效應。

1.3.5 乳液的pH穩定性

在37 ℃下，每種乳狀液均用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl溶液調節至不同pH值(3.0～8.0)，攪拌30 min，測定平均粒徑和Zeta電位值。

1.3.6 靜態體外消化模型

參考前人方法制備口腔(simulated salivary fluid，SSF)、胃(simulated gastric fluid，SGF)、小腸(simulated intestinal fluid，SIF)3部分的體外模擬消化液[12]。

口腔階段：將5 mL樣品(含20 g/L的油)與 4 mL SSF(pH=7.0)混合，添加25 μL 0.3 mol/L的CaCl2·2H2O溶液并加足去離子水，以獲得總體積為10 mL的溶液。在37 ℃恒溫培養箱中100 r/min振蕩2 min。

胃階段：將口腔消化產物與8 mL SGF(含終體系酶活為2 000 U/mL的胃蛋白酶)混合，添加5 μL 0.3 mol/L的CaCl2·2H2O。調節pH值至3.0，并加足去離子水以獲得總體積為20 mL的溶液。在37 ℃恒溫培養箱中100 r/min振蕩2 h。

小腸階段：將胃消化產物轉移至雙層酶反應器中，與10 mL SIF(pH=7.0)混合，依次添加3.5 mL膽鹽溶液(53.57 mg/mL溶于SIF)，1.33 mL 0.3 mol/L的CaCl2·2H2O溶液和2.5 mL胰脂肪酶溶液(24 mg/mL溶于SIF)。調節pH值至7.0，并加足去離子水以獲得總體積為40 mL的溶液。在37 ℃下反應4 h，期間用0.1 mol/L NaOH滴定以維持體系pH值在7.0，并記錄NaOH消耗量。

1.3.7 游離脂肪酸釋放率的測定

利用滴定法監測小腸消化階段的游離脂肪酸(free fat acid，FFA)釋放量。根據1個三酰甘油分子可在酶解作用下釋放2個FFA的最大釋放量來計算乳液釋放的FFA百分比，如公式(1)所示：

(1)

式中：VNaOH，滴定消耗的NaOH的體積，L；mNaOH，摩爾濃度，0.1 mol/L；Mlipid，亞麻籽油的平均分子質量，873 g/mol；wlipid，小腸消化階段脂質的質量，0.1 g。

1.4 數據處理

每個實驗3次平行，所有數據均表示為平均值±標準差。使用SPSS Statistics(Version 17.0)軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 乳液的pH穩定性

有研究表明[7]，與酸性不穩定乳狀液相比，在胃環境中具有更高酸穩定性的乳狀液可以誘導產生更強的飽腹感。而在小腸的中性環境中，利用絮凝或聚集效應降低液滴的比表面積，有助于延緩脂質消化，也可達到增強飽腹感的目的[13]。因此，我們研究了不同pH值對乳液穩定性的影響(圖1)。相對于W，W-P和W-A在pH 4～5下的平均粒徑均降低，可能因為PC和ALG的界面吸附增加了乳狀液的界面層厚度，產生的空間位阻效應增強了乳液體系的穩定性[14]。而在pH 3的條件下，相對于W-P，W-A的平均粒徑偏高，可能因為W-A界面上的大量ALG分子在該pH值下形成了海藻酸凝膠，溶解度大幅度下降，喪失了對液滴的穩定作用，導致粒徑增加。反之，W-C則具有較好的酸穩定性，但在中性或堿性條件下，CS的溶解度變低，促使液滴絮凝，粒徑變大。

圖1 初級乳液和各二級乳液在不同pH下的平均粒徑Fig.1 Particle size of primary and secondary emulsions under different pH values注：“*”表示該pH條件下乳狀液的粒徑數值大于10 000 nm(下同)

之后，我們在W-P的基礎上進一步吸附CS以構建W-P-C三級乳液。圖2中的粒徑結果表明，該三級乳液在pH 3和pH 4時有較高的穩定性，而隨著pH升高至中性，粒徑顯著增大，說明該乳液體系滿足了在酸性胃環境中穩定，而在中性腸環境中失穩的預期需求。

圖2 三級乳液在不同pH下的平均粒徑Fig.2 Particle size of tertiary emulsions under different pH values

不同pH條件下，初級乳液、各二級乳液和三級乳液的Zeta電位如圖3所示。其中，W-P-C的Zeta電位由正值轉為負值，且絕對值先變小后變大。據此推測，在低pH下，由于WPI、PC、CS分別帶有適量的正負電荷，三級乳液的層與層間發生較強的靜電吸附作用而使體系相對穩定。當pH繼續升高至偏中性時，由于CS溶解度的下降，最外層結構開始崩解，WPI帶電性逐漸轉為陰性，而PC也為陰性，這2層間的相互作用逐漸減小，所以該三級乳液在pH 6～7時產生了明顯的不穩定現象[15]。

圖3 各級乳狀液在不同pH下的Zeta電位Fig.3 Zeta potential of primary, secondary and tertiary emulsions under different pH values

2.2 乳液在胃環境中的酸穩定性

經2 h胃消化后，W和W-A的平均粒徑顯著增大(圖4)，圖5的宏觀相分離現象也顯示出這2者有明顯的液滴聚結效應。而W-C也呈現出清晰的分層界線，因CS與WPI均帶正電荷而使CS從界面上脫離下來，導致WPI依然可被胃蛋白酶消化而削弱了黏彈性界面結構[16]，使乳液漂浮在胃液頂部。W-P和W-P-C的粒徑分布變化不明顯，說明界面層上PC的吸附限制了蛋白質的水解并阻止了液滴的絮凝，呈現出較強的分層穩定性(圖5)。綜上，只有W-P和W-P-C滿足胃環境穩定性的要求，因此只有這2種體系才可被考慮用于體外模擬小腸消化的后續研究。

a-初始；b-口腔；c-胃圖4 各級乳狀液經過各消化階段后的粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of primary, secondary and tertiary emulsions after exposure to different stages of the simulated gastrointestinal tract

圖5 各級乳狀液經胃模擬消化后的相分離現象Fig.5 Phase separation of primary, secondary and tertiary emulsions after exposure to the simulated gastric digestion

2.3 乳液在小腸環境中的油脂消化速率

經過4 h的模擬消化后，各級乳液游離脂肪酸的最終釋放比例均達到88%以上，接近完全消化(圖6)，說明油滴表面的蛋白或多糖在消化過程中逐漸解離下來，導致脂肪酶可直接吸附在油水界面并發生酶解。這些聚合物的解離現象可歸因于以下幾點：(1)因pH環境的變化，蛋白和多糖的帶電量發生改變，靜電吸附作用減弱，多層結構逐步解體；(2)膽鹽因其較強的表面活性，可與界面上的蛋白和多糖分子競爭吸附[17-18]；(3)作為油脂消化產物的2-單甘酯和游離脂肪酸也具有一定的表面活性，兩者可替換部分蛋白和多糖。而這些親脂性小分子物質無法抵抗油滴的聚結[19]，導致后續脂肪酸的釋放速率趨于平緩。

隨著多層結構中吸附層數的增加，總游離脂肪酸釋放量有所下降。消化初始階段，部分PC由于其表面活性仍吸附在油滴表面，作為底物和消化酶間的物理屏障。隨著消化時間的延續，CS在中性環境中的溶解度急劇下降，導致液滴出現絮凝或聚集現象，減少了胰脂肪酶的可作用面積。而CS又是弱的陰離子交換劑[20]，可與膽鹽結合，降低其增溶能力，促進消化產物在表面的積累，影響后續酶解反應的進行。

由圖6-b可知，三級乳液相對于初級乳液，前2 h的游離脂肪酸釋放量減少了20%以上，而后期則增加了10%以上。說明該多層結構可延緩油脂消化，但又不會完全抑制酶解。先前有學者通過體外模擬實驗證明，在乳液外層添加CS有助于控制脂質消化速率，但繼續添加PC時，反而降低了其延緩油脂消化的有效性，該研究認為當CS與陰離子聚合物形成復合物后，就不能有效抑制油脂消化[21]。這與本研究得到的實驗結果存在差異，可能是因為層與層之間的吸附順序不同導致各層的聚合物濃度也不同，在該研究構建的三級乳液中，少量的CS被體系中占比更大的PC所利用，影響了CS干擾油脂消化的能力。

a-動力學曲線；b-前2 h和后2 h的總釋放率圖6 各級乳狀液在小腸模擬消化過程中的游離脂肪酸釋放情況Fig.6 Percent of released fatty acids during the simulated small intestinal digestion

3 結論

本研究以乳清分離蛋白為內層，分別以果膠、海藻酸鈉、殼聚糖為外層構建多層乳液，探討了不同界面組成對乳狀液油滴在體外模擬胃腸道中的消化特性的影響。結果顯示，只有由果膠構建的二級乳液以及由果膠和殼聚糖共同構建的三級乳液滿足胃環境的酸穩定性要求，其可在2 h的胃模擬消化過程中保持較好的分層穩定性。其中，由果膠與殼聚糖共同包裹的三級乳液可進一步加劇油滴在小腸的中性環境中絮凝或聚結的程度。根據小腸階段的體外模擬實驗結果可知，隨著乳狀液界面組成層數的增加，油脂消化速率降低。同時，相對于初級乳液和二級乳液，三級乳液前期的游離脂肪酸釋放量減少，而后期的游離脂肪酸釋放量增加。因此，由果膠和殼聚糖構建的三級乳液具有延緩油脂消化能力，同時又不完全阻礙脂解反應，適用于生產通過誘導飽腹感效應來控制食欲的功能性食品。