陰虛質骨質疏松癥患者血清中差異蛋白篩選研究

黃睿，謝興文，李鼎鵬，徐世紅，林德民，鐘建春

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.西北民族大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省第二人民醫院，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）已成為嚴重威脅我國老年人健康的主要疾病[1]。我國OP 總患病率約為13%，推測至2050 年患病人數可能上升至5.33 億[2]。骨質疏松性骨折是OP 嚴重并發癥，尤其是髖部骨折，其病死率高，患者多在骨折后1 年內死亡[3]。中醫體質學說源于《黃帝內經》，主要表現在形態結構、生理機能及心理狀態等方面。個體存在體質差異，影響一些特定疾病罹患率[4]。近年來，越來越多的研究開始關注中醫體質與OP 相關性。有研究對廣州某醫院OP患者進行分析，發現陰虛質患者最多（28.7%）[5]。陰虛質發生骨質疏松性骨折的風險較高[6]，對該體質進行研究具有較高臨床價值。

蛋白質組學是研究蛋白質位置、功能、生物學過程及其相互作用的一門科學，在功能水平上研究基因表達[7]，是生命科學研究領域的重要工具，用于尋找疾病生物學標志物，探究疾病發生機制。差異蛋白質組學TMT 技術屬于串聯質譜標簽技術的一種，較凝膠定量技術可以檢測更多類型的蛋白質分子[8]，現已廣泛應用于中醫藥研究領域。本研究采用TMT 技術篩選陰虛質OP 患者血清中的差異蛋白，旨在篩選陰虛質OP 潛在的血清生物蛋白標志物，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

受試者來自蘭州市五泉、西固福二路2 個社區，共3 000 人。于2019 年12 月對受試者進行問卷調查，檢測骨密度并采集血清。將受試者血清貯存于甘肅省中醫院生物樣本庫-80 ℃冰箱內，按腰椎（L2～L4）骨密度水平分為OP 患者和非OP 者。通過問卷調查收集基本資料并判定中醫體質。OP 患者961 例，其中陰虛質52 例（男性11 例、女性41 例）。采用隨機數字表法從陰虛質OP 患者中選取32 例為陰虛質OP組，包括男性7 例、女性25 例，年齡52～80 歲，平均年齡（66.10±7.60）歲。經匹配年齡、性別后，選擇平和質OP 組32 例，包括男性7 例、女性25 例，年齡52～81 歲，平均年齡（65.59±7.49）歲；平和質非OP 組32 例，包括男性7 例、女性25 例，年齡46～75 歲，平均（61.00±8.00）歲。3 組一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經甘肅省中醫院倫理委員會審查批準（2018-027-01）。

1.2 西醫診斷標準

參照《原發性骨質疏松癥診療指南（2017）》[9]，以雙能X 線吸收法（DXA）測量腰椎骨密度（L2～L4）。正常值：T 值≥-1；骨量減少：-2.5＜T 值＜-1；骨質疏松：T 值≤-2.5。

1.3 中醫體質判定

按照《中醫體質分類與判定》量表[10]，每個問題按1～5 分劃分為5 級評分，計算原始分和轉化分，判定體質類型。平和質轉化分≥60 分且其他偏頗體質轉化分均＜30 分時判定為平和質，陰虛質轉化分≥40分且余體質轉化分＜30 分時判定為單一陰虛質。

1.4 納入標準

①女性年齡≥45 歲，男性年齡≥50 歲；②陰虛質OP 組：臨床診斷為原發性OP 且判定為單一陰虛質；③平和質OP 組：臨床診斷為原發性OP 且判定為平和質；④平和質非OP 組：臨床未診斷OP，判定為平和質的健康受試者；⑤所有受試者均對本研究知情，并簽署知情同意書。

1.5 排除標準

①因內分泌代謝疾病、腫瘤、肝腎疾病、風濕免疫性疾病等導致的繼發性OP；②伴重癥心腦血管疾病及神經精神系統疾病；③伴惡性骨腫瘤、骨結核、骨髓炎等其他骨科疾病；④四肢及脊柱有內固定或心臟安裝起搏器；⑤近2 年接受過抗骨質疏松治療，使用過影響骨代謝的藥物及接受過雌激素治療；⑥不配合研究，資料不全。

1.6 血清樣本處理

血清樣本解凍，4 ℃、2 500 r/min 離心10 min，取上清液分裝于Eppendorf 管，每組8 例做一混樣，陰虛質OP 組、平和質OP 組、平和質非OP 組各4 個樣本。

1.7 蛋白質提取

取凍存血清，各組每個樣本血清取10 μL，分別混合均勻，運用SDT 裂解法，在待測血清樣本中加入適量4%SDT 裂解液，沸水中水浴15 min。使用-20 ℃低溫高速離心機14 000 r/min 離心15 min 取上清液。分裝樣品，-20 ℃保存。鑒定每個樣本中蛋白，進行SDS-PAGE 電泳并定量各蛋白的濃度及總量。

1.8 輔助濾劑樣品制備裂解

樣品取150 μg 蛋白質溶液，分別加入DTT 至終濃度為100 mmol/L，于沸水浴后冷卻至室溫。加入200 μL UA buffer 混勻并離心，棄濾液，重復該步驟1次。加入100 μL IAA buffer，振蕩避光反應后離心。加入100 μL UA buffer 再次離心，重復2 次。加入NH4HCO3溶液離心，重復2 次。加入40 μL Trypsin buffer，振蕩后37 ℃放置16～18 h。換新收集管，離心15 min；再加入NH4HCO3溶液，離心15 min，收集濾液。采用C18Cartridge 對肽段進行脫鹽，肽段凍干后加入甲酸溶液復溶，肽段定量（OD280）。

1.9 TMT 標記

用三乙基碳酸氫銨復溶樣品，將TMT 試劑分別注入各樣品中，常溫放置1 h，分別注入5%氨水終止反應，室溫靜置10 min。在樣品中加入10%三氟乙酸，pH值保持2.0 以下，可使樣品與柱結合更充分。經脫鹽、洗脫后，將0.1%甲酸溶液加入凍干后肽段中，備用。

1.10 質譜分析及鑒定

每份樣品采用納升流速Easy nLC 系統進行分離。緩沖液A 液為0.1%甲酸水溶液，B 液為0.1%甲酸乙腈水溶液。色譜柱以100%A 液平衡，樣品由自動進樣器上樣到分析柱分離。樣品經色譜分離后用Q Exactive plus 質譜儀進行質譜分析。分析時長120 min，檢測方式為正離子，母離子掃描范圍350～1 800 m/z，一級質譜分辨率為70 000，AGC target 為3×106，一級Maximum IT 為50 ms。多肽和多肽碎片的質量電荷比按以下流程采集：每次全掃描后采集10 個碎片圖譜（MS2 scan），MS2 Activation Type 為HCD，Isolation window 為1.6 m/z，二級質譜分辨率為35 000，Microscans 為1，二級Maximum IT 為120 ms，Normalized Collision Energy 為30 eV。

1.11 分析方法

1.11.1 蛋白質定量分析

采用高分辨質譜儀 Q Exactive plus（Thermo Fisher Scientific）進行TMT 定量蛋白質組學分析。Q Exactive plus 是Orbitrap 類型質譜儀，使用快速HCD模式（higher energy collisional dissociation）獲得MS2圖譜，使用Proteome Discoverer 2.1（Thermo Fisher Scientific）[11]將Q Exactive plus 產生的原始圖譜文件進行轉化，通過軟件內置工具提交至MASCOT2.6 服務器進行檢索。再通過Proteome Discoverer 2.1 將MASCOT 服務器上形成的查庫文件傳回軟件，根據FDR＜0.01 標準篩選數據。

1.11.2 主成分分析

主成分分析（PCA）用于觀察各組樣本的自然聚集、離散及離群點，提取篩選到的各組樣本差異蛋白對應的表達值，采用Excel2016 整合數據，并運用R4.0.2 軟件將數據投射至二維空間，每個樣本用二維空間的一個點表示，相同組分樣本形成的點彼此靠近。

1.11.3 生物信息學分析

采用上述方法篩選出的蛋白，比較陰虛質OP 組、平和質OP 組和平和質非OP 組表達水平。當差異表達差異倍數＞1.2（上調）或＜0.83（下調），且P＜0.05，則視為差異表達的蛋白。將篩選到的陰虛質OP組與平和質非OP 組的差異蛋白與陰虛質OP 組與平和質OP 組、平和質OP 組與平和質非OP 組所鑒定的蛋白進行對比，判斷其是否為陰虛質及OP 共同作用下的特異性差異蛋白。對陰虛質OP 組與平和質非OP 組的特異性差異蛋白，通過UniProt 數據庫和Blast2GO[12]和InterProScan[13]進行基因功能注釋。對其生物過程、細胞組分和分子功能進行分析，利用KEGG 數據庫對目標蛋白質集合進行通路注釋。

1.12 統計學方法

采用SPSS23.0 統計軟件進行分析。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蛋白質定量和鑒定結果

經SDS-PAGE 電泳后，陰虛質OP 組、平和質非OP 組和平和質OP 組樣本抽提效率高，樣本中蛋白質含量豐富，各組樣本蛋白質定量結果見表1。蛋白質相對分子量主要分布在10～90 kD（見圖1），蛋白質主要等電分布點在5～10（見圖2）；肽段序列長度分布見圖3；肽段序列覆蓋度顯示，鑒定到的蛋白質覆蓋率比例較高（見圖4）；蛋白質豐度比分布顯示，3 組樣品定量結果中大部分蛋白質豐度比值接近1（見圖5）。

圖1 鑒定蛋白質相對分子量分布

圖2 鑒定蛋白質等電分布點

圖3 肽段序列長度分布

圖4 蛋白質序列覆蓋度分布

圖5 蛋白質豐度比分布

表1 各組樣本蛋白質定量結果

2.2 血清差異表達蛋白篩選結果

根據質譜分析結果，陰虛質OP 組與平和質非OP組共鑒定了734 種蛋白，其中差異表達蛋白5 種。陰虛質OP 組較平和質非OP 組上調蛋白5 種，包括RAB7A、PON1 及3 種炎癥免疫反應相關蛋白，無蛋白顯著下調（見表2）。

表2 陰虛質OP 組與平和質非OP 組差異蛋白

將5 種差異蛋白與陰虛質OP 組與平和質OP 組、平和質OP 組與平和質非OP 組鑒定到的蛋白進行對比。陰虛質OP 組與平和質OP 組鑒定到其中的4 種（IGLV3-21、IGHV-α-2、RAB7A、PON1），4 種蛋白陰虛質OP 組與平和質OP 組比較差異無統計學意義（P＞0.05），蛋白IGHV1-69-2 在陰虛質OP 組與平和質OP 組比較中未被鑒定及定量（見表3）。

表3 陰虛質OP 組與平和質OP 組差異蛋白表達比較

平和質OP 與平和質非OP 組鑒定出5 種差異蛋白中的4 種（IGLV3-21、IGHV-α-2、RAB7A、PON1），4 種蛋白平和質OP 組與非OP 組比較差異無統計學意義（P＞0.05），蛋白IGHV1-69-2 在平和質OP 組與非OP 組的比較中未被鑒定及定量（見表4）。

表4 平和質OP 組與非OP 組差異蛋白表達比較

2.3 主成分分析結果

PCA 結果顯示，平面圖上陰虛質OP 組主成分與平和質非OP 組、平和質OP 組聚類的區域區分度明顯（見圖6）。

圖6 差異蛋白各組樣本PCA 圖

2.4 陰虛質骨質疏松癥患者差異蛋白功能及通路注釋分析

對鑒定和定量到的陰虛質OP 組的5 種差異蛋白行功能注釋和富集分析：按細胞組分歸為11 類，這些蛋白都是細胞成分和蛋白質復合體，4 個蛋白胞外區組分，各有2 個是細胞膜成分和細胞器成分，1 個是突觸成分，1 個是超分子化合物，5 個蛋白都分布于細胞膜、胞外區，3 個分布于細胞器，1 個位于細胞連接；按分子功能劃分，5 個蛋白都有結合功能及催化功能；生物過程方面，存在差異的5 個蛋白都參與了代謝過程、免疫過程、生物調節過程和應激反應，4 個蛋白參與細胞定位，3 個蛋白參與多組織生物過程，2 個蛋白參與了多細胞生物過程和細胞結構的組成和發生過程，各有1 個蛋白參與轉運過程和解毒過程（見圖7）。

圖7 陰虛質OP 組差異蛋白GO 富集分析

對主要富集的蛋白功能進行逐一分析發現，細胞組分主要富集在自噬體膜、溶酶體膜外成分、黑素體膜、反轉錄復合物、IgA 免疫球蛋白復合物，分子功能主要富集在抗原結合、催化芳二烷基磷酸酶、催化二氫香豆素水解酶、依賴GTP 的蛋白結合、芳基酯酶的催化，參與的生物過程主要富集在Fc-epsilon receptor信號通路、蛋白質靶向溶酶體、表皮生長因子分解代謝、內體向溶酶體轉運、初級內體向次級內體轉運等過程（見圖8）。對鑒定到的差異蛋白進行KEGG 通路注釋分析，發現差異蛋白主要富集于自噬通路及動物線粒體自噬信號通路。主要富集的自噬通路注釋見圖9。

圖8 陰虛質OP 組差異表達蛋白GO 富集分析（前10 位）

圖9 陰虛質OP 組差異表達蛋白主要富集的自噬通路注釋

3 討論

中醫體質學說重視個體差異，體質影響疾病發生與預后[14-15]。近年來隨著蛋白質組學、基因組學等學科的發展，越來越多的研究開始從微觀角度探究中醫病證本質。針對陰虛質OP 患者血清中差異蛋白的研究，可以探索陰虛質OP 的發病機制，有助于開發早期診斷試劑盒，并為陰虛質OP 靶向藥物開發提供靶點。本研究篩選出的差異蛋白有3 個屬于免疫球蛋白范疇，即IGHV1-69-2、IGLV3-21、IGHV-α-2。其中，IGHV1-69-2 和IGHV-α-2 屬于重鏈免疫球蛋白，由免疫球蛋白重鏈位點（IGH）編碼可變基因并經過轉錄、加工和翻譯而形成[16]，IGLV3-21 屬輕鏈免疫球蛋白，由B 淋巴細胞分化而來的漿細胞產生[17]。這些蛋白參與炎癥反應、疾病急性期反應及免疫調節[18]。董偉[19]研究發現，陰虛質人群血清中白細胞介素（IL）-2、干擾素-γ 的表達水平較平和質人群升高，提示陰虛質人群存在免疫功能減弱情況，免疫功能下降使陰虛質較平和質人群更易發生感染，從而引發炎癥反應。孫淑嫻[20]研究發現，陰虛質人群免疫炎癥相關蛋白存在差異表達，表明陰虛人群免疫功能存在紊亂。研究顯示，骨骼系統和免疫系統存在相互作用，因為骨骼系統和免疫系統有共同起源，破骨細胞、單核細胞和巨噬細胞均由造血干細胞分化而來[21]。2 個系統存在共同的細胞因子、受體和轉錄因子，免疫細胞接受傳導信息能對成骨細胞和破骨細胞產生調節作用。當免疫系統發生紊亂時，骨重建受到影響，引發OP[22]。如活化的T 細胞能分泌Th17 細胞提高IL-17 水平，在骨破壞進程中，IL-17 可通過調節IL-1、腫瘤壞死因子合成更多的促炎性介質，加速骨破壞[23]。本研究顯示，陰虛質OP 組血清中存在3 個免疫球蛋白上調，提示陰虛質OP 患者可能存在免疫功能紊亂，其發生OP 的原因可能是免疫系統紊亂導致骨流失增加。

RAB 蛋白屬GTP 酶家族，主要參與膜轉運過程。RAB7 是RAB 家族中的一種小G 蛋白，哺乳動物有RAB7A 和RAB7B 亞型，二者在膜轉運不同階段起作用。RAB7A 含有208 個氨基酸，主要位于晚期核內體，調節早期核內體向晚期核內體及晚期內體向溶酶體的轉運[24]。RAB7A 的功能與自噬密切相關。有研究認為，自噬活動亢進是陰虛特征之一[25]。自噬水平平衡與中醫陰陽自和及陰陽平衡思想具有相似性。陰陽自和指陰陽具有自我調整平衡的能力，生理狀態下陰陽二氣自我協調，病理狀態下二者自我平衡，形成動態平衡。細胞自噬亦屬于微環境中的動態平衡，當外界環境變化時，細胞通過自噬對其作出反應[26]。中醫理論中的陰陽依據事物特性進行劃分，自噬過程中清除的細胞內廢舊代謝物質屬陰，新合成的物質及能力屬陽[25]，當陰陽偏衰時，內外界因素變化和刺激可能使陰陽平衡被打破，隨之導致自噬紊亂。過度自噬使陰虛質人群在代謝過程中清除細胞的功能亢進，存在分解骨代謝產物過快情況，成骨細胞-破骨細胞平衡被打破，導致骨流失增加[27-28]。自噬在OP 發病過程中被認為是骨細胞存活的重要機制之一。骨丟失進程也可能與骨細胞自噬有關[29]。成骨細胞穩態依靠自噬活動來維持，還能調節成骨細胞活性，保持骨髓間充質干細胞性狀[30-31]。結合本研究中陰虛質OP 患者血清中RAB7A 表達顯著高于平和質非OP 者，且陰虛質OP 組與平和質OP 組、平和質OP 組和平和質非OP 組間RAB7A 的表達水平無顯著差異，推測RAB7A可能是陰虛質OP 特異性的血清蛋白生物標志物。

對氧磷酶（PON）是一種由肝臟合成的水解酶，PON1 是其3 種亞型之一，具有強烈親酯性的高密度脂蛋白相關酯酶。PON1 的表達和活性主要受基因遺傳多態性影響，與氧化應激相關多種疾病有關，包括冠狀動脈硬化性心臟病、糖尿病、腫瘤及黃斑變性等[32]。氧化應激主要表現為人體內氧化和抗氧化平衡被打破，該過程會產生大量氧自由基，導致損傷部位中性粒細胞浸潤，產生慢性炎癥效應[33]。動物實驗顯示，陰虛大鼠模型由于細胞免疫功能及抗感染功能被抑制而產生炎癥效應[34]，臨床研究亦顯示陰虛患者體內炎癥因子水平上升[35]，同樣表現為炎癥效應，我們推測陰虛質的產生可能與氧化應激的致炎作用有關。氧化應激對破骨細胞的分化及激活有促進作用，提高骨吸收能力[36]，是OP 潛在的危險因素。PON1 與骨代謝及OP 相關，其作用機制是PON1 的抗氧化能力可保護骨骼免受氧化應激反應。人體在新陳代謝過程中會持續產生自由基，如果抗氧化和氧化作用失去平衡，活性氧不能及時清除而發生累積。累積的活性氧損傷了成骨細胞及骨細胞，導致骨形成減少，骨破壞增加，從而引發OP[37]。本研究顯示，PON1 表達水平在陰虛質OP 患者血清呈現高表達，陰虛質與平和質及OP 與非OP 間的表達水平差異無統計學意義，其可能是陰虛質OP 患者血清中特有的差異蛋白。

本研究尚存在一定局限性：如篩選出陰虛質OP 患者血清中的差異顯著的蛋白5 個，其中3 個是功能未知蛋白，隨著蛋白質組學發展，其功能會逐漸被認知。生物信息學分析結果仍需進一步的實驗研究來闡明其具體機制。今后我們將對相關蛋白進行多中心、大樣本驗證，以確定其是否為陰虛質OP 可靠的血清蛋白生物學標志物。

綜上所述，本研究通過TMT 技術篩選了陰虛質OP 患者血清中的差異蛋白，發現5 個蛋白表達存在顯著差異。其中RAB7A 與自噬密切相關，PON1 與氧化應激反應存在關聯。體現出陰虛質OP 的發生發展可能與自噬和氧化應激反應存在重要聯系，它們可能是陰虛質OP 潛在的血清生物學標志物。本研究結果可為OP 微觀診斷及藥物精準干預提供新方法，也為陰虛質OP 發生發展的機制探索提供思路。