肝X受體β基因多態(tài)性與2型糖尿病易感性的相關(guān)性

羅 杰，郭 蕾，陳陽希，楊 晨，朱小蔚，嚴(yán)妤函，萬文輝，張興虎，劉 瑜

0 引 言

2型糖尿病(type 2 diabetes, T2DM)是遺傳與環(huán)境因素相互作用導(dǎo)致的一種常見的代謝性疾病。各種病因?qū)е麦w內(nèi)胰島素分泌不足或不能有效利用胰島素，從而出現(xiàn)機(jī)體對葡萄糖不耐受引起血糖水平升高[1]。隨著我國人口老齡化和生活方式的改變，T2DM的發(fā)病率逐年升高，T2DM及其相關(guān)并發(fā)癥已成為影響我國居民健康的重大疾病之一。T2DM的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，家族聚集性發(fā)病提示遺傳因素參與T2DM發(fā)病[2-3]。發(fā)現(xiàn)與T2DM相關(guān)的基因能更好地理解T2DM的發(fā)病機(jī)制，并為治療提供新的靶點(diǎn)。

肝X受體(liver X receptor, LXR)屬于核受體超家族成員，本質(zhì)上是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，氧化的膽固醇衍生物是其天然配體。LXR被配體激活后，需要與視黃醛X受體(retinoid X receptor，RXR)結(jié)合形成異二聚體(LXR-RXR)而具有轉(zhuǎn)錄活性。活化的LXR再與靶基因上特異的LXR反應(yīng)元件(LXR response element，LXRE)結(jié)合，通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[4]。人體LXR有兩種亞型，LXRα和LXRβ。LXRα主要分布在肝、脾、腎、小腸、脂肪組織等，而LXRβ廣泛分布于人體各組織，胰腺中主要為LXRβ[5]。已證實(shí)，LXR的很多靶基因參與了糖和脂代謝調(diào)節(jié)，與胰島素抵抗及糖尿病發(fā)生過程密切相關(guān)[6]。因此，LXR基因是T2DM遺傳學(xué)研究的候選基因，其變異可能影響T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究在華東漢族人群中，觀察LXRβ基因上常見單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)與T2DM易感性的關(guān)系，為進(jìn)一步探討T2DM發(fā)病機(jī)制及風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2018年1-12月在東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院門診體檢中心進(jìn)行健康體檢的患者510例，其中T2DM 128例(T2DM組)，對照者382例(對照組)。研究對象年齡≥18歲、漢族、籍貫均為江蘇及其周邊地區(qū)且相互間無生物學(xué)親緣關(guān)系。排除既往有內(nèi)分泌疾病、胰腺切除、慢性肝腎疾病及服用影響糖代謝藥物者和孕婦。2型糖尿病的診斷根據(jù)既往病史(目前正在接受胰島素或口服降糖藥物治療)和此次體檢結(jié)果(符合2010年美國糖尿病協(xié)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn))。對照者均經(jīng)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)證實(shí)無糖代謝異常存在(包括無空腹血糖受損、糖耐量異常和糖尿病)。510例受試對象均采空腹靜脈血4 mL并經(jīng)乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)抗凝，-80 ℃凍存以備后續(xù)提取基因組DNA。收集受試對象社會(huì)人口學(xué)資料、既往病史等，測量腰臀比，計(jì)算體重指數(shù)(body mass index, BMI)。本研究通過原南京軍區(qū)南京總醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號為：2017NZGKJ-079)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 SNP位點(diǎn)的選擇及基因分型根據(jù)“常見疾病-常見變異”假說[7]，選擇LXRβ基因上常見的SNP位點(diǎn)。首先，在線Pubmed搜索LXRβ基因多態(tài)性與疾病關(guān)聯(lián)研究中常選擇的SNP位點(diǎn)；其次，查閱美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)的dbSNP數(shù)據(jù)庫，找到位于基因功能區(qū)的SNP位點(diǎn)；最后，從HapMap數(shù)據(jù)庫中選擇北京漢族人群樣本，以r2>0.8得到標(biāo)簽SNP(tag SNP)。從以上得到的SNP位點(diǎn)中選擇在中國人群中次要等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)> 10%為本研究選擇的位點(diǎn)(共6個(gè))，見表1。采用TIANGENTM試劑盒提取基因組DNA并行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)控和定量。基因分型采用上海天昊生物科技有限公司改良的連接酶檢測反應(yīng)(improved ligase detection reaction，imLDR)技術(shù)。所有SNP位點(diǎn)的基因分型成功率均大于95%。分型結(jié)束后，隨機(jī)選擇10%的樣品進(jìn)行重復(fù)檢測，一致性率為100%。

表1 肝X受體β基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)信息

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較510例研究對象中，年齡26～77歲，平均年齡(52.76±14.28)歲，其中男290例(56.86%)，女220例(43.14%)。T2DM組與對照組相比年齡較大(P=0.003)，空腹血糖水平較高(P<0.001)，具有較高的BMI和腰臀比(P<0.001)。T2DM組具有較高的高血壓病、冠心病、高脂血癥發(fā)病率(P均<0.01)。見表2。

表2 入組研究對象臨床特征比較

2.2 LXRβ基因多態(tài)性與T2DM及體型的相關(guān)性各SNP位點(diǎn)在對照組中的頻率分布符合哈代-溫伯格平衡。校正年齡、性別、吸煙、飲酒、既往史后，非條件Logistic回歸分析顯示，其中rs2695121 TT基因型(OR [95%CI]= 0.48[0.25～0.85],P=0.042)和CT+TT基因型(OR [95%CI]= 0.72[0.31～0.98],P=0.038)發(fā)生T2DM的風(fēng)險(xiǎn)較CC基因型低，見表3。各基因型與BMI和腰臀比無相關(guān)性，見表4。

表3 rs2695121基因型與T2DM的相關(guān)性[n(%)]

表4 LXRβ各位點(diǎn)基因型與BMI和腰臀比的相關(guān)性

3 討 論

肝X受體是糖代謝的重要調(diào)節(jié)者，它能直接感受血中葡萄糖的變化[8]。LXR激活后主要通過以下機(jī)制降低血糖：① 抑制肝糖異生酶—磷酸烯醇式丙酮酸酯羧化激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)和果糖1，6二磷酸酶(FBP1)的表達(dá)，從而抑制了糖的生成；② 上調(diào)肌肉和脂肪組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(主要是GLUT1和GLUT1)的表達(dá)，增加肌肉和脂肪組織對血糖的攝取；③ 增加胰腺β細(xì)胞的胰島素分泌；④ 通過其抗炎癥作用和對糖皮質(zhì)激素活性的抑制(抑制肝1型11β羥基類固醇脫氫酶)提高機(jī)體對胰島素的敏感性[9-11]。LXR是調(diào)節(jié)糖代謝的關(guān)鍵基因，LXRα主要與脂代謝相關(guān)，而LXRβ與糖代謝更相關(guān)。因此，本研究以LXRβ(NR1H2)為候選基因，首次在華東漢族人群中觀察LXRβ基因上6個(gè)常見SNPs與T2DM和人體體型指標(biāo)的相關(guān)性，在校正年齡、性別、吸煙飲酒、既往史后，發(fā)現(xiàn)rs2695121多態(tài)性與T2DM相關(guān)，TT/CT+TT基因型者較CC型T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低，提示該位點(diǎn)的變異對T2DM發(fā)病有保護(hù)作用。

LXRβ基因位于染色體19q13.3上，由10個(gè)外顯子組成，為相對保守基因。已有研究證實(shí)，多個(gè)LXRβ基因多態(tài)性位點(diǎn)與T2DM或肥胖發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。rs17373080(C→G)位于LXRβ基因啟動(dòng)子區(qū)，體外研究發(fā)現(xiàn)C等位基因型具有較高的轉(zhuǎn)錄活性[12]。Dahlman等[12]在法國人群中發(fā)現(xiàn)rs17373080 GG基因型對T2DM發(fā)病具有保護(hù)作用；Solaas等[13]在歐洲人群中得到了同樣的結(jié)果，rs17373080(G)能夠降低T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(保護(hù))，但與超重、肥胖有關(guān)(促進(jìn))，這與在LXRβ基因缺陷大鼠中觀察到的不同，且這些作用是似乎是矛盾的。原因是LXRβ在抑制肝糖異生、促進(jìn)脂肪和肌肉組織對葡萄糖的攝取的同時(shí)，可增加肌管細(xì)胞脂肪酸的吸收和脂積累，增加三酰甘油水平。此外，SNPs可能誘導(dǎo)不同輔助因子的招募，從而改變LXRβ對靶基因的作用，此外還有表觀遺傳的影響、物種間的差異等。rs2248949(C→T)位于內(nèi)含子6，Ketterer等[14]在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)，T較C等位基因第一時(shí)相胰島素分泌減少。此外，該突變還影響胰島素原轉(zhuǎn)換為胰島素過程，T等位基因攜帶者的胰島素產(chǎn)生量比C等位基因純合個(gè)體減少18%。在本研究中，并未發(fā)現(xiàn)rs17373080和rs2248949與T2DM或BMI、腰臀比相關(guān)。rs2695121(C→T)位于內(nèi)含子2，是研究報(bào)道比較多的一個(gè)位點(diǎn)。有關(guān)rs2695121與T2DM或肥胖的相關(guān)性，在不同的人群中得到的結(jié)果不一致： Dahlman等[15]在法國人群中發(fā)現(xiàn) rs2695121(T)與肥胖相關(guān)，Rooki等[16]在伊朗人群中發(fā)現(xiàn)rs2695121 TT基因型發(fā)生代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)較CC型下降53%，Solaas等[13]在歐洲人群未發(fā)現(xiàn)rs2695121與T2DM、肥胖/超重有關(guān)，但rs2695121(T)空腹胰島素水平較低。Mehrad-Majd等[17]在伊朗東北部人口中也未發(fā)現(xiàn)rs2695121與肥胖相關(guān)，而與血壓相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)rs2695121與T2DM發(fā)病相關(guān)，TT/CT+TT基因型者較CC型T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低，提示該位點(diǎn)的變異對T2DM發(fā)病有保護(hù)作用，并未發(fā)現(xiàn)rs2695121與BMI或腰臀比相關(guān)。造成結(jié)果不一致的原因可能為種族的不同以及樣本量較小等，查閱ensembl數(shù)據(jù)庫rs2695121 T等位基因在中國人群中的頻率(11.4%～16.7%)明顯小于歐洲人(36.4%～56.6%)。rs2695121位于內(nèi)含子2，它影響T2DM的機(jī)制還不清楚，有可能通過影響mRNA的剪切、穩(wěn)定性或定位來影響基因的功能，或是通過與基因中其他具有生物活性的SNP連鎖而表現(xiàn)出功能[18]。

目前，在全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)中并未發(fā)現(xiàn)LXRβ基因多態(tài)性與T2DM或肥胖相關(guān)。由于GWAS所需的p值閾值非常低(<10-8)，而LXRβ與T2DM相關(guān)性較弱可能未報(bào)道。GWAS并沒有涵蓋每個(gè)基因的全部遺傳變異。因此，候選基因方法仍有助于檢測SNP與疾病之間的關(guān)聯(lián)[19]。本研究中由于樣本均來自于醫(yī)院，存在選擇偏倚。但病例和對照者籍貫均為江蘇及其周邊地區(qū)，最大程度避免了人群混雜對結(jié)果的影響。同樣，由于樣本量相對較少，統(tǒng)計(jì)效力不夠，一些相關(guān)性可能發(fā)現(xiàn)不了，也不排除陽性位點(diǎn)因和其他與T2DM有關(guān)的SNPs位點(diǎn)連鎖，而表現(xiàn)出與T2DM相關(guān)。研究中未對胰島素水平和胰島分泌功能進(jìn)行檢測，健康對照中可能有一部分未來會(huì)進(jìn)展為T2DM患者，但即使存在對照組混入少量的病例，相關(guān)性仍然存在，該陽性結(jié)果更有價(jià)值。最后，隨著dbSNP數(shù)據(jù)庫和HapMap數(shù)據(jù)庫不斷完善，不排除該基因中還有其他位點(diǎn)與T2DM相關(guān)。對于本研究結(jié)果還需要更大樣本量或meta分析來進(jìn)一步驗(yàn)證。LXRβ通過對其靶基因進(jìn)行調(diào)控而發(fā)揮作用，靶基因本身也存在著基因多態(tài)性，也與疾病相關(guān)，因此，對LXRβ和其靶基因聯(lián)合研究更有助于理解基因變異對疾病的影響。