補腎單味中藥對絕經后骨質疏松癥骨代謝信號通路調控機制的研究進展*

鄧 婕，安方玉，顏春魯，汪永鋒，賀娟娟，呂學穎，趙崇博，蔣國鳳

(1.甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫藥大學教學實驗實訓中心，甘肅 蘭州 730000； 3.甘肅中醫藥大學中西醫結合學院，甘肅 蘭州 730000； 4.甘肅中醫藥大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000； 5.甘肅中醫藥大學中醫臨床學院，甘肅 蘭州 730000)

世界衛生組織報道，骨質疏松癥是一種以礦化骨組織減少、微結構骨組織惡化為特征的骨骼疾病，可導致骨質脆弱風險增加，骨折易感性增加[1]。骨質疏松癥的發病率隨著年齡的增長而增加，且最常發生于絕經后婦女，其主要病機可能是婦女絕經后，雌激素分泌缺乏而引發破骨細胞異常活躍，導致骨吸收障礙和整體骨丟失[2]。

對于絕經后骨質疏松癥的治療常采用激素替代療法，但是長期的激素治療會引發心腦血管疾病及各類癌癥的發生，極大地影響了其臨床療效的發揮。因此，開發高效、安全、低毒、能有效預防過度骨丟失的新型藥物迫在眉睫。如何降低絕經后骨質疏松癥的發病率、提高臨床治療效果成為研究者關注的焦點。中醫學將骨質疏松癥歸為 “骨枯”“骨痹”范疇，主要采用中藥、針灸、推拿等治療手段，取得了一定的臨床療效。治療絕經后骨質疏松癥時，根據中醫學“腎主骨”理論，多選擇補腎中藥；但目前其治療機制尚無詳細總結，尤其是針對單味補腎中藥的治療機制總結更少。為此，本文通過總結近年來單味補腎中藥對絕經后骨質疏松癥骨代謝信號通路的調控機制，為補腎中藥的臨床應用提供理論依據。

1 絕經后骨質疏松癥的治療現狀

絕經后骨質疏松癥有多種治療手段，包括標準治療和其他療法。標準治療常用膳食鈣和維生素D,其他療法主要采用雙磷酸鹽、選擇性雌激素受體調節劑(selective estrogen receptor modulators，SERM)、雌激素和甲狀旁腺激素類似物。這些療法雖然能顯著降低骨折發生率，但對非脊椎骨折的療效有限，且不良事件的發生限制了其應用[3]。使用中草藥治療絕經后骨質疏松癥療效良好，成本更低，副作用少。近年來，臨床大力提倡中醫診治及中西醫聯合治療，以減少單純西藥治療的不良反應。以“腎藏精”“腎主骨”為理論支撐，補腎壯骨法成為治療絕經后骨質疏松癥的有效方法，得到了許多學者的認可。

2 絕經后骨質疏松癥骨代謝相關信號通路

2.1 Wnt 基因(Wnt)/β連環蛋白(β-catenin)信號通路

Wnt信號通路通過促進骨形成、抑制骨吸收從而重建骨平衡，對骨骼發育和骨形成有著至關重要的作用，與骨質疏松的發生與發展密切相關。Wnt信號通路分為經典和非經典兩大類，參與骨質疏松發生、發展的主要是經典的Wnt 信號通路。

經典的Wnt 信號通路由Wnt配體、Wnt受體、卷曲蛋白Frizzled 家族跨膜受體蛋白(frizzled，Frz)和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(low density lipoprotein receptor related protein 5/6,LRP 5/6)共同組成[4]。β-連環蛋白(β-catenin)作為Wnt 信號通路的開關控制器，通過調節Wnt 信號通路的β-catenin進一步控制相關基因的轉錄。Wnt與Frz結合形成的復合物促進了LRP的磷酸化，磷酸化的LRP促使糖原合成激酶3β(Glycogen synthesis kinase-3β，GSK-3β)的解體，從而促進了β-catenin的穩定和積累。積聚在細胞質中的β-catenin會向細胞核中移動并在細胞核中與淋巴增強因子/T細胞因子(lymphatic enhancement factor/T-cell factor，Lef/Tcf)相互作用，最終Lef/Tcf轉錄因子激活使成骨細胞特異性基因得以表達[5]。此外，Wnt 信號通路的胞外調制器主要包括兩種類型的天然抑制劑，一種是Wnt抑制因子1(Wnt inhibitory factor 1,WIF1)，能夠結合并中和Wnt蛋白，溶解Frz受體，阻止Wnt與其受體結合；另一種為拮抗蛋白Dickkopf(DKK)和硬化蛋白(recombinant sclerostin，SOST)，能與Wnt配體競爭性的結合Wnt受體，從而阻斷該通路。其中，SOST幾乎只能表達于骨細胞中，不僅抑制成骨細胞的形成還具有破壞骨的作用；但其明確的作用機制尚未闡明，有待于進一步的研究[6]。相關研究發現，骨質疏松組中骨組織的Wnt-3a的表達明顯降低[7]，去勢骨質疏松大鼠骨組織中拮抗蛋白Dickkopf相關蛋白1(Dickkopf related protein 1,DKK1)基因表達的減少，可減輕骨量和相關生物力學的損失[8]。樊萍通過研究發現，DKK1可抑制Wnt/β-catenin信號通路，并與β-連環蛋白的表達呈負相關，這為早期臨床通過針對DKK1的靶向治療預防絕經后骨質疏松提供了一定的理論支撐[9]。最新研究[10]發現：成骨細胞中長鏈非編碼RNA Crnde的過表達促進了成骨細胞的增殖；反之，Crnde的低或不表達抑制了成骨細胞的增殖。Crnde的這一調節作用可以通過Wnt/β-catenin信號通路來實現，并同時調節骨形成。這表明Crnde是骨質疏松癥的一種新的骨代謝調節因子。因此，筆者推測，可以通過促進Crnde的表達來治療骨退行性疾病。此為臨床治療提供了一定的思路。此外，有學者研究發現，富含亮氨酸的重復序列包含G蛋白偶聯受體6(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 6，LGR6)高度表達于成骨細胞的祖細胞，促進骨生成，并且能夠增強β-catenin的穩定性，從而加強Wnt信號通路[11]。由此，通過調控Wnt信號通路中的相關蛋白Wnt、DKK-1、β-catenin、SOST、Crnde和LGR6的表達可達到預防與治療骨質疏松的目的，尤其是最新發現的Crnde可能是未來補腎中藥篩選的有效靶點。

2.2 骨保護素/核因子κB受體激動子/核因子κB受體激動子配體信號通路

中醫學多從脾腎兩方面對骨調節機制進行研究，骨保護素(osteoprotegerin，OPG)/核因子κB受體激動子(receptor activator of nuclear factor κB，RANK)/核因子κB受體激動子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)信號通路的發現開創了中醫研究骨質疏松的新紀元[12]。該通路主要是由OPG、RANK和RANKL組成，RANKL與其破骨細胞前體上的受體RANK結合，招募腫瘤壞死因子(TNF)受體相關因子，而這些因子是銜接蛋白和泛素連接酶，調節NF-κB、JNK、c-Fos、NFATc1-ERK、p38、NFATc1和AKT信號，從而控制正常和病理性骨吸收中破骨細胞的形成和活性[13]。 RANK與RANKL結合能夠加速骨吸收，RANK是破骨細胞表達的天然受體；OPG作為誘餌受體能夠阻斷RANK和RANKL的結合，致破骨細胞的增殖、活性等均有所下降，進一步促進其凋亡[14]。

在人體內，成骨細胞和破骨細胞在多種作用因子的耦連作用下使人體維持骨平衡。破骨細胞的生長需要核受體激活劑NF-κB受體活化因子和成骨細胞分泌蛋白。除此之外，成骨細胞能夠分泌破骨細胞生成抑制因子或誘餌受體[15]。有學者[17]對補腎OPG/RANKL/RANK信號通路干預激素性股骨頭壞死進行了實驗研究，結果發現激素性股骨頭壞死模型小鼠RANK和RANKL表達均上調，OPG表達下調，從而有效地緩解絕經后骨質疏松癥的癥狀。另有學者也發現，骨質疏松模型鼠RANK和RANKL表達的上調和OPG表達的下調[17]。可見，通過調節RANKL誘導的信號通路來抑制破骨細胞的形成是治療絕經后骨質疏松癥等與破骨細胞相關疾病的一種可行的治療策略。

3 補腎單味中藥治療絕經后骨質疏松癥骨代謝信號通路的調控機制

3.1 單味中藥淫羊藿和杜仲對骨代謝Wnt/β-catenin信號通路的調控機制研究

淫羊藿最早收載于《神農本草經》，歷史悠久，成分復雜，有效成分主要為淫羊藿苷、朝藿定 A、朝藿定 B、 朝藿定 C、淫羊藿次苷Ⅰ、寶藿苷Ⅰ和寶藿苷Ⅱ等黃酮類成分[18]，以骨保護作用為主的活性成分主要是淫羊藿苷。周先進等[19]研究發現，淫羊藿苷主要通過上調成骨細胞β-catenin 及Runx2 等成骨基因的表達來促進成骨細胞的增殖與分化，進一步促進骨的生長。涂艷等[20]研究發現，淫羊藿苷也可提高骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)GSK-3、LEF-1的水平，通過進一步激活Wnt/β-catenin信號通路來促進BMSC的成骨分化。Wei等[21]研究指出，0.1 μmol/L淫羊藿苷能顯著提高堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性，同時還可以顯著上調成骨基因(Runx2、osteopotin、DLX5、骨鈣素、Ⅰ型膠原和ERα)和Wnt信號分子(β-catenin、Lef1、TCF7、c-jun、c-myc和cyclin D)的表達。淫羊藿苷也可以通過刺激β-catenin的活化來促進β-catenin的核移位。尹素娟[22]研究發現，淫羊藿可通過上調Wnt/β-catenin信號通路中Lrp6受體mRNA的表達，增加GSK-3β mRNA的磷酸化，使得更多的β-catenin在細胞核中積累，從而激活Wnt/β-catenin信號通路，刺激Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因Runx2 mRNA表達。據此推測，淫羊藿對成骨細胞增殖和分化的調控主要是通過激活Wnt/β-catenin信號通路的成骨細胞調控基因Runx2、osteopotin、DLX5、骨鈣素、Ⅰ型膠原、β-catenin、Lef1、TCF7、c-jun、c-myc和cyclin D等實現的。

杜仲有補肝腎、強筋骨之功效，性微甘,味辛溫，是我國名貴的滋補藥材[23]。現代研究表明，杜仲可改善骨微觀結構，增加骨密度，促進骨形成[24]。李三華等[25]通過實驗研究了杜仲總黃酮對去卵巢大鼠骨代謝的影響，結果表明，雌激素缺乏的大鼠骨形成的能力低于骨吸收，杜仲總黃酮有抑制骨吸收、促進骨形成的作用。趙亮等[26]通過研究鹽炙杜仲對去卵巢骨質疏松大鼠骨代謝生化指標的影響發現，高劑量杜仲可提高絕經后骨質疏松大鼠血清中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和成骨細胞中酸性蛋白的表達，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRACP)的表達，發揮加速骨形成的作用，對絕經后骨質疏松具有一定的治療作用。同時，駱瑤等[27]的研究表明，杜仲提取物可顯著升高血清中雌二醇的表達，從而有效改善骨密度和骨小梁微結構，發揮對絕經后骨質疏松大鼠的骨保護作用。此外，杜仲還可與熟地黃、枸杞子等中藥聯合使用，在絕經后骨質疏松的治療中共同發揮補益肝腎的效用。因此，杜仲對骨形成的調控作用可能是激活Wnt/β-catenin 信號通路中促成骨形成因子Wnt-3a、β-catenin及ALP、雌二醇、酸性蛋白、TRACP的表達來發揮作用。

綜上所述，淫羊藿和杜仲都是通過激活Wnt/β-catenin信號通路的促成骨形成因子的表達從而加速了骨形成，顯著改善了絕經后骨質疏松骨微結構的破壞，促進了絕經后骨質疏松的骨重建而發揮治療作用。

3.2 單味中藥蛇床子、淫羊藿、巴戟天對骨代謝OPG/RANK/ RANKL信號通路的調控機制研究

中藥蛇床子性苦而溫，《本草從新》載其有 “強陽益陰，補腎祛寒，祛風燥濕”的功效，可防治骨質疏松。沃小敏等[28]報道，蛇床子可以通過促進OPG的基因表達和抑制RANKL的基因表達來提高OPG/RANKL的比值，從而抑制破骨細胞的分化、增殖，減少骨吸收，進一步降低骨質疏松癥的發生，并在一定程度上延緩了骨質疏松的發展。趙永見等[29]通過觀察不同劑量蛇床子素對 OPG 基因敲除小鼠骨代謝的影響發現，不同劑量蛇床子素可以提高OPG 基因敲除小鼠的BMD，并增加骨小梁的厚度、降低骨小梁的分離度，以中劑量最為顯著。研究表明，佛手苷內酯來源于蛇床子屬植物，是一種香豆素衍生物，通過減少RANKL誘導的破骨細胞生成和骨吸收來抑制絕經后骨質疏松，而沒有任何細胞毒性。這些抗吸收作用和抗破骨細胞的特性表明，佛手苷內酯是預防或治療絕經后骨質疏松癥的一個有效的候選藥物[30]。因此，蛇床子的治療機制主要是通過提高OPG，降低RANKL的表達來增加骨密度，調節骨代謝，從而治療骨質疏松癥及疼痛等并發癥。

淫羊藿性溫味苦，歸肝腎經，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕之效。研究表明，淫羊藿黃銅提取物具有類雌激素作用，可用于有效治療絕經后骨質疏松[31]。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，淫羊藿苷可抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的骨吸收和白細胞介素-6及腫瘤壞死因子-α的表達，同時可上調OPG基因表達和下調RANKL的基因表達，還可抑制LPS介導的破骨細胞p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的激活，降低LPS誘導的成骨細胞細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2)和核因子κB的抑制蛋白α(inhibitor α of NF-κB，I-κB α)的激活，從而被稱為天然抗骨質疏松的藥物[32]。此外，淫羊藿中兩種同分異構體黃酮CIT和IT對骨質疏松大鼠有治療作用。其中，CIT主要作用是上調OPG，下調RANKL，降低血清AKP和TRACP水平，異構化黃酮(CIT/IT)與OPG/RANKL靶點的聯合作用減弱了OPG或RANKL對RANKL的激發作用。由于CIT與RANKL的結合比IT更牢固，所以CIT通過抑制骨吸收而具有更強的抗骨質疏松作用[33]。吳峻[34]采用淫羊藿苷對去卵巢大鼠進行干預，結果發現，淫羊藿苷不僅可以增加骨密度和骨礦含量，還可以顯著上調骨組織中OPG mRNA的表達并下調RANKL mRNA、RANK mRNA的表達，從而調節成骨與破骨的骨平衡，在一定程度上緩解了絕經后骨質疏松癥的疼痛，有一定的治療作用。研究表明,淫羊藿苷可以抑制RANKL誘導的破骨細胞轉錄因子c-Fos和活化T細胞核因子1(nuclear factor-activated T cell 1，NFATc1)的表達，抑制下游破骨細胞特異性標記物[35]。 綜上所述，淫羊藿苷通過抑制NF-κB和MAPK活化來實現對RANKL誘導的破骨細胞的形成和功能的抑制。這些發現表明其有效成分淫羊藿苷有望成為未來治療骨質疏松癥的有效藥物。

《神農本草經》記載，巴戟天“主大風邪氣，陽痿不起，強筋骨，安五臟，補中益氣”，具有補腎壯陽、強筋健骨、祛除風濕等功效[36]。林華芳等[37]發現，巴戟天可以通過抑制去勢大鼠骨組織中 RANK、活化 T 細胞核因子信號通路2(NFAT2)和空泡型 V-ATP酶(V-ATP)mRNA的表達從而抑制破骨細胞的增殖，減少去勢大鼠的骨丟失。胡英勇等[38]通過觀察巴戟天提取物對去勢大鼠骨質疏松癥的防治作用發現，巴戟天可提高去勢骨質疏松癥大鼠骨密度、骨鈣含量及血清中雌二醇的表達，推測其可通過調節激素水平從而改善骨質疏松。鄭德開等[39]發現，巴戟天對骨質疏松的治療通過調控OPG/RANK/RANKL信號通路中OPG水平的升高、RANKL水平的降低來發揮促進成骨抑制破骨的作用。楊博辰等[40]通過研究巴戟天與雌激素對骨質疏松大鼠破骨細胞 RANK 和 碳酸酐酶Ⅱ(carbonic anhydrase Ⅱ,CAⅡ)的表達，發現巴戟天與雌激素對CAII、RANK mRNA的表達具有顯著的抑制作用，使破骨細胞水平降低，有效減少骨吸收。Bao等[41]通過研究巴戟天蒽醌類化合物體外抑制破骨細胞骨吸收發現，巴戟天有效成分蒽醌對RANKL誘導的NF-κB和JNK的磷酸化有明顯的抑制作用，從而降低RANKL的表達，提高OPG/RANKL的相對比值，有效緩解絕經后骨質疏松癥。因此，筆者推測，巴戟天對于絕經后骨質疏松的防治作用主要是通過激活OPG/RANK/RANKL通路中促成骨因子OPG的表達、抑制RANKL、CAII的表達來有效緩解絕經后骨質疏松引起的骨丟失。

綜上所述，蛇床子、淫羊藿、巴戟天等補腎單味中藥抗絕經后骨質疏松的共同機制是通過激活OPG/RANK/RANKL信號通路中OPG的表達，抑制其通路中RANKL的表達，最終使OPG/RANKL比值降低，進而抑制破骨細胞的增殖和促進成骨細胞的分化，從而促進骨質疏松的骨形成和抑制其骨破壞。

4 小 結

近年來，隨著絕經后骨質疏松發病機制研究的不斷深入，國內外對信號通路機制的研究也逐步引起重視，以信號通路為靶點的補腎中藥療效篩選將是今后研究的重點。本綜述發現，影響絕經后骨質疏松骨代謝的信號通路主要是Wnt/ β-catenin信號通路和OPG/RANK/RANKL信號通路。通過激活或抑制上述信號通路中的關鍵蛋白，可有效防治絕經后骨質疏松癥。此外，本綜述也發現，補腎單味中藥在治療絕經后骨質疏松中也可通過調控Wnt/β-catenin信號通路的關鍵蛋白Wnt、DKK、β-catenin、SOST、Crnde、Runx2、LGR6的表達,OPG/RANK/RANKL信號通路的關鍵蛋白OPG、RANK、RANKL的表達，從而促進成骨細胞形成、增殖和分化，達到防治絕經后骨質疏松癥的目的(見圖1)。但是鑒于中藥作用方式的多樣性、多器官性及多靶點性等特點，上述補腎單味中藥對信號通路的調控究竟以哪條為主、哪條為輔，以及這些信號通路之間是否存在交互作用，這也將成為未來研究的方向。

圖1 補腎單味中藥抗絕經后骨質疏松的作用機制