miRNA-451在宮頸癌中的表達及對宮頸癌Hela細胞增殖與凋亡影響的作用機制研究△

李艷，陳文玉，陳小平，陳友國

1鹽城市第一人民醫院/南京大學醫學院附屬鹽城第一醫院婦產科，江蘇 鹽城 224001

2蘇州大學附屬第一醫院婦產科，江蘇 蘇州 215006

宮頸癌是臨床最常見的女性惡性腫瘤之一，其發病率居女性所有惡性腫瘤的第二位，病死率居首位。流行病學調查結果顯示，全球每年新增宮頸癌約60萬例，新增病死30萬例，嚴重威脅女性的生命健康。值得注意的是，中國每年新增宮頸癌患者超過全球新增宮頸癌病例的1/5，且呈年輕化趨勢，發病率和病死率遠高于發達國家，嚴重影響中國女性的生命健康。宮頸癌的發生發展與多種因素有關，但目前臨床關于宮頸癌的發病機制仍未完全闡明。早期宮頸癌多無明顯癥狀，極大地影響了宮頸癌患者的早期臨床診斷和治療，因此，積極探索宮頸癌早期診斷和治療的生物標志物對臨床宮頸癌的診斷和治療有重要意義。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種內源性小分子非編碼RNA。近年來，越來越多的研究表明，miRNA能夠調節多種基因的表達，對多種腫瘤增殖、凋亡、侵襲轉移等惡性生物學行為有調控作用。miRNA-451是miRNA家族的重要成員之一，能夠通過調節磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）等多種信號通路，抑制肝癌、胃癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤發生發展，被認為是一種重要的抑癌因子。研究表明，miRNA-451在肝癌等腫瘤發生發展過程中異常表達，而miRNA-451過表達能夠明顯抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和轉移，被認為是肝癌預防和治療的潛在生物靶點。但miRNA-451表達情況與宮頸癌發生發展關系的研究較少，因此，本研究探討miRNA-451在宮頸癌組織中的表達及其與患者臨床特征的相關性，并通過體外細胞實驗探討miRNA-451-mimics瞬時轉染對宮頸癌Hela細胞增殖與凋亡的影響及可能機制，旨在為今后宮頸癌的臨床診斷和治療提供理論依據，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月至2018年12月鹽城市第一人民醫院收治的60例宮頸癌患者。納入標準：均為初次確診；均經病理學檢查確診為宮頸癌；術前未進行放療、化療等治療。排除標準：術前進行化療、放療或激素治療；肝腎功能不全或合并其他惡性腫瘤。60例宮頸癌患者年齡20～65歲；病理類型：鱗狀細胞癌37例，腺癌23例；國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期39例；淋巴結轉移26例，無淋巴結轉移34例；分化程度：低分化19例，中高分化41例；基層浸潤深度：≥1/2 35例，＜1/2 25例。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。取60例宮頸癌患者的宮頸癌組織和相應癌旁正常組織，迅速置于液氮中冷凍，-80℃保存待檢。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞、主要試劑和儀器 人宮頸癌Hela細胞株購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所?？俁NA提取試劑盒、定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒、無酶水均購自天根生化科技（北京）有限公司，miRNA-451模擬物（miRNA-451-mimics）、miRNA-451-mimics陰性對照（miRNA-451-mimics-NC）均購自上海吉瑪制藥技術有限公司，miRNA-451上游引物、下游引物和探針均由上海星漢生物科技有限公司設計合成，胎牛血清、青霉素-鏈霉素、DMEM培養基均購自美國Gibco公司，CCK-8試劑購自日本同仁化學研究所，Lipofectamine3000轉染試劑購自美國Thermo Scientific公司，細胞周期檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒均購自江蘇凱基生物技術公司，磷酸化AKT（phosphoinositide AKT，p-AKT）、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、β-actin一抗和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗均購自美國CST公司。實時熒光定量PCR儀、酶標儀均購自美國Bio-Rad公司，CO培養箱購自美國Thermo Scientific公司，流式細胞儀購自美國艾森公司，離心機購自上海舜制儀器公司，轉印電泳儀購自北京六一公司，轉膜儀購自美國Hoefer公司。

1.2.2 qRT-PCR檢測宮頸癌組織和癌旁正常組織中miRNA-451的相對表達量 采用RNA提取試劑盒提取宮頸癌組織和癌旁正常組織中的總RNA，逆轉錄為互補DNA（complementary DNA，cDNA），采用qRT-PCR法檢測miRNA-451的相對表達量。qRT-PCR反應體系為：cDNA 1μl，上下游引物 1 μl，PCR 熒光定量染料 5 μl，無酶水 4 μl。PCR擴增條件：95℃預變性2 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40個循環。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，采用 2法計算miRNA-451的相對表達量。GAPDH上游引物：5'-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3'，下游引物：5'-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3'；miRNA-451上游引物：5'-AAAGTCGACAAGCTCTCTGCTCAGCCTGTC-3'，下游引物：5'-AAAATATCTCGAGCCCCCACCCCTGCCTTGT-3'。

1.2.3 細胞培養與轉染 宮頸癌Hela細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5% CO細胞培養箱中培養，取對數生長期的細胞用于后續實驗。將Hela細胞隨機分為對照組、miRNA-451-mimics組和miRNA-451-mimics-NC組，分別取20μg的miRNA-451-mimics和miRNA-451-mimics-NC加入至10 ml培養基中，并分別加入20μl的Lipofectamine3000轉染試劑輕輕混合均勻，室溫下孵育20 min后取適量加入至各組細胞中，對照組加入等量培養基，每組設3個復孔。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞的增殖能力 取對照組和 miRNA-451-mimics組細胞分別轉染 6、12、24、36、48 h，qRT-PCR法檢測miRNA-451的相對表達量。取對照組、miRNA-451-mimics組及miRNA-451-mimics-NC組細胞，以5000/孔接種至96孔板，每組設6個復孔，分別轉染6、12、24、36、48 h后，每孔加入10μl的CCK-8試劑繼續培養2 h。采用酶標儀于450 nm波長處測定各孔吸光度（A），計算細胞存活率。細胞存活率（%）＝（A-A）（/A-A）×100%。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞周期情況 采用流式細胞儀檢測miRNA-451-mimics瞬時轉染對Hela細胞周期的影響。取轉染24 h后的對照組、miRNA-451-mimics組及miRNA-451-mimics-NC組細胞，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗3遍后收集細胞，用75%乙醇固定12 h，離心去除乙醇后加入PBS重懸細胞然后加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑500 μl，避光孵育15 min后，使用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況，上述實驗重復3次。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 運用流式細胞儀檢測miRNA-451-mimics瞬時轉染對宮頸癌Hela細胞凋亡的影響。取轉染24 h后的對照組、miRNA-451-mimics組及miRNA-451-mimics-NC組細胞，棄去上清液，PBS清洗3次后收集細胞，加入500μl結合液重懸細胞后分別加入膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/PI試劑各 5 μl，避光孵育15 min后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實驗重復3次。細胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.7 蛋白質印跡（Western blot）法檢測p-AKT、Bcl-2蛋白的相對表達量 取轉染24 h后對照組、miRNA-451-mimics組及miRNA-451-mimics-NC組宮頸癌Hela細胞，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）測定各組細胞蛋白濃度制備蛋白樣品。取30μg蛋白樣品經過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后，運用轉膜儀將蛋白轉至固相載體聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。運用5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入p-AKT、Bcl-2、β-actin一抗（稀釋濃度均為1∶1000）孵育過夜，然后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋濃度為1∶10 000）室溫孵育1 h，電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）法檢測并用Image J 2.0圖像軟件進行灰度值分析，實驗重復3次。以β-actin作為內參，計算p-AKT、Bcl-2蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 宮頸癌組織和癌旁正常組織中miRNA-451相對表達量的比較

癌旁正常組織中miRNA-451的相對表達量為（6.808±2.402），明顯高于宮頸癌組織中的（1.165±0.415），差異有統計學意義（t=17.78，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中miRNA-451表達情況的比較

以宮頸癌組織中miRNA-451相對表達量的中位數為界值，miRNA-451低表達30例，miRNA-451高表達30例。不同年齡、病理類型、肌層浸潤深度宮頸癌患者宮頸癌組織中miRNA-451表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同FIGO分期、淋巴結轉移情況、分化程度宮頸癌患者宮頸癌組織中miRNA-451表達情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中miRNA-451相對表達量的比較（n=60）

2.3 不同轉染時間宮頸癌Hela細胞中miRNA-451相對表達量和增殖能力的比較

隨著轉染時間的延長，miRNA-451-mimics組宮頸癌Hela細胞中miRNA-451的相對表達量均明顯升高（P＜0.05），且轉染24 h時，miRNA-451-mimics的轉染效率最高，因此選擇轉染24 h作為后續實驗轉染條件。隨著轉染時間的延長，miRNA-451-mimics組宮頸癌Hela細胞的存活率逐漸降低。（表2、表3）

表2 不同轉染時間宮頸癌Hela細胞中miRNA-451相對表達量的比較（±s）

表3 不同轉染時間宮頸癌Hela細胞的存活率（%，±s）

2.4 miRNA-451過表達對宮頸癌Hela細胞周期的影響

轉染24 h后，miRNA-451-mimics組細胞G/G期細胞百分比明顯高于對照組和miRNA-451-mimics-NC組，G/M期細胞百分比明顯低于對照組和miRNA-451-mimics-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；但3組S期細胞百分比比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（圖1、表4）

表4 miRNA-451過表達對宮頸癌Hela細胞周期的影響（%，±s）

圖1 miRNA-451過表達對宮頸癌Hela細胞周期的影響

2.5 miRNA-451過表達對宮頸癌Hela細胞凋亡的影響

轉染24 h后，miRNA-451-mimics組細胞的凋亡率為（33.727±2.096）%，明顯高于對照組的（0.883±0.246）%和 miRNA-451-mimics-NC組的（1.660±0.649）%，差異均有統計學意義（t=22.12、20.77，P＜0.1）。（圖2）

圖2 miRNA-451過表達對宮頸癌Hela細胞凋亡的影響

2.6 miRNA-451過表達對宮頸癌Hela細胞p-AKT、Bcl-2蛋白相對表達量的影響

miRNA-451-mimics組宮頸癌Hela細胞p-AKT、Bcl-2蛋白的相對表達量均明顯低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表5）

表5 對照組與miRNA-451過表達組宮頸癌Hela細胞p-AKT、Bcl-2蛋白相對表達量的比較（±s）

3 討論

宮頸癌是臨床常見的女性惡性腫瘤，2018年全球宮頸癌調查研究報告顯示，中國宮頸癌發病率明顯高于歐美等發達國家，且呈年輕化趨勢，嚴重威脅女性生命健康。此外，宮頸癌患者的預后較差，5年生存率低于50%，且其發生發展過程復雜，與細胞增殖、侵襲轉移、基因異常表達、凋亡等多種過程密切相關。早期診斷、早期治療，對降低宮頸癌患者的病死率、提高生存質量、改善預后均有重要意義。但由于宮頸癌早期缺乏特異性的癥狀，容易造成漏診和誤診。因此，積極尋找宮頸癌發生發展過程中的生物標志物對臨床宮頸癌的早期診斷和靶向治療有重要意義。

miRNA是一類由內源基因編碼的單鏈非編碼RNA，對多種基因表達具有調控作用，在惡性腫瘤的發生發展中發揮著重要作用。越來越多的研究表明，miRNA調控基因的表達與宮頸癌的發生發展密切相關。值得注意的是，miRNA在血清和組織中的穩定性高，具有作為宮頸癌臨床診斷標志物和治療靶點的潛能。研究表明，miRNA-145、miRNA-34a、miRNA-206、miRNA-21等多種miRNA在宮頸癌發生發展過程中有重要作用。Anusha等研究表明，miRNA-145能夠通過靶向SMAD 作用蛋白 1（SMAD-interacting protein 1，SIP1）調節宮頸癌細胞的上皮-間充質轉化過程，抑制細胞的增殖、遷移和侵襲。miRNA-206是一種抑癌基因，能夠明顯抑制肝癌等多種惡性腫瘤的發生。Chen等的研究表明，miRNA-206與宮頸癌發生發展及患者的預后相關，被認為是一個潛在的宮頸癌診斷及治療靶標。

miRNA-451位于人第17號染色體，是一種與細胞代謝密切相關的miRNA，具有抑制多種腫瘤發生發展的作用，被認為是一種潛在的抗腫瘤治療的生物標志物。研究表明，miRNA-451能夠靶向調控PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號通路，從而抑制多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移過程，在腫瘤診斷、病情監測及靶向治療方面有巨大的應用價值。

本研究結果顯示，宮頸癌患者宮頸癌組織中miRNA-451的相對表達量明顯低于癌旁正常組織，且與宮頸癌患者的FIGO分期、淋巴結轉移情況及分化程度可能有關，表明miRNA-451可能有抑制宮頸癌發生發展的作用。因此，進一步進行體外細胞實驗探討miRNA-451過表達對宮頸癌Hela細胞增殖與凋亡的影響及可能的機制，結果表明，轉染后，miRNA-451-mimics組宮頸癌Hela細胞的存活率明顯降低，miRNA-451過表達能夠將宮頸癌Hela細胞的周期阻滯于G/G期并明顯促進細胞凋亡。AKT是一種重要的調節分子，與細胞增殖分化、能量代謝及惡性腫瘤發生發展等多種過程密切相關。Zhang等的研究結果表明，宮頸癌的發生發展過程中，AKT的表達水平明顯升高，與宮頸癌發生發展及不良預后明顯相關。Bcl-2是AKT下游重要的抗凋亡蛋白，與多種腫瘤發生及惡性轉化密切相關。本研究結果表明，miRNA-451-mimics瞬時轉染能夠明顯降低宮頸癌Hela細胞中p-AKT、Bcl-2蛋白的相對表達量，表明miRNA-451能夠通過抑制p-AKT、Bcl-2蛋白的表達，抑制宮頸癌Hela細胞的增殖并誘導其凋亡。由此可見，miRNA-451在宮頸癌組織中低表達，且與宮頸癌患者FIGO分期、淋巴結轉移、分化程度相關，其過表達能通過阻斷AKT/Bcl-2信號通路來抑制宮頸癌細胞的增殖并誘導其凋亡。

綜上所述，miRNA-451能夠通過阻斷AKT/Bcl-2信號通路，抑制宮頸癌Hela細胞的增殖并誘導其凋亡，從而抑制宮頸癌的發生發展過程，有可能成為宮頸癌臨床診斷、病情監測及靶向治療的生物標志物。