prospero同源框 1下調(diào)對人膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲的影響

張興業(yè)，田博，郭少春，賀延莉

空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院1神經(jīng)外科，2放射科，西安 710038

prospero同源框1（prospero homeobox 1，PROX1）是Prospero基因相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，屬于同源盒轉(zhuǎn)錄因子中的一員，在哺乳動物各器官包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。它通過不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式控制細胞的增殖和分化，具有致癌或抑癌功能。研究發(fā)現(xiàn)，PROX1可調(diào)控食管癌、口腔癌、小細胞肺癌和肝癌等多種腫瘤的發(fā)展。早期研究顯示，PROX1在膠質(zhì)瘤細胞株中表達，且其表達與膠質(zhì)瘤病理分級呈正相關(guān)。然而PROX1在膠質(zhì)瘤細胞中的作用尚不清楚。本研究旨在探討PROX1對膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)功能的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與材料

正常人膠質(zhì)細胞系HEB購自中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院；人膠質(zhì)細胞瘤細胞（glioblastoma，GBM）系 A172（GBM，Ⅳ級）、U87MG（GBM，Ⅳ級）、U-118MG（GBM，Ⅳ級）、SHG-44（GBM，Ⅳ級）和U251（GBM，Ⅳ級）均購自中科院細胞庫。DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；Trizol試劑盒和Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司；噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國R&D公司；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司。PROX1引物、GAPDH引物均由中國上海生工生物工程有限公司合成；兔抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體、波形蛋白（Vimentin）抗體、β-肌動蛋白（β-actin）抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗均購自美國Abcam公司；PROX1 siRNA、scramble siRNA均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

細胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至80%融合時進行傳代。

1.3 轉(zhuǎn)染及分組

將細胞接種于6孔板，待融合率達80%，將細胞分為對照組、scrambled siRNA組和PROX1 siRNA組。PROX1 siRNA組用Lipofectamine?2000將PROX1 siRNA轉(zhuǎn)染細胞，scrambled siRNA組轉(zhuǎn)染scrambled siRNA，作為陰性對照。

1.4 MTT法檢測細胞增殖

將轉(zhuǎn)染后的細胞接種于96孔板中（3×10/孔），37℃連續(xù)培養(yǎng)96 h。分別于24、48、72、96 h向每孔加入MTT 20 μl（5 mg/ml），4 h后，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入100 μl二甲基亞砜，振蕩10 min溶解沉淀，用酶標儀于490 nm處檢測吸光度（A）值。

1.5 Transwell法檢測細胞侵襲

將細胞（1×10/孔）接種于無血清培養(yǎng)基，Matrigel膠鋪于Transwell小室上表面，上室加入200 μl細胞懸液，下室加入600 μl常規(guī)培養(yǎng)基，24 h后取出小室，棄去上室液體，用棉球擦盡上室的未穿膜細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗后，用甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，清洗后顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)，計算平均值。

1.6 Western blot法檢測蛋白表達

收集各組細胞，提取細胞總蛋白，并用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，取等量蛋白20 μl進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗人PROX1（1∶2000）、E-cadherin 抗體（1∶500）、N-cadherin抗體（1∶1000）、Vimentin抗體（1∶1000），4℃孵育過夜。TBST漂洗3次后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶5000），室溫反應(yīng)2 h。TBST漂洗后加入增強型化學(xué)發(fā)光試劑采用電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）法顯色發(fā)光，觀察蛋白表達。用Image J軟件對結(jié)果進行灰度值分析并定量。以β-actin為內(nèi)參。

1.7 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction ，qRT-PCR）檢測PROX 1 mRNA表達

用Trizol試劑提取細胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板熒光定量PCR擴增。引物序列如下：PROX1上游引物5'-AAAGCAAAGCTCATGTTTTTTTATA-3'，下游引物5'-GTAAAACTCACGGAAATTGCTAAA-3'；GAPDH上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。PCR反應(yīng)條件：95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PROX 1蛋白和mRNA表達水平的比較

Western blot和qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，PROX1在人膠質(zhì)瘤細胞A172、U87MG、U118MG、SHG-44和U251中蛋白和mRNA的表達水平均高于正常人膠質(zhì)細胞HEB，且U118MG和U87MG細胞中PROX1蛋白和mRNA表達水平均高于其他人膠質(zhì)瘤細胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 人膠質(zhì)瘤細胞和正常人膠-質(zhì)細胞中PROX 1 mRNA和蛋白表達水平的比較（±s）

2.2 轉(zhuǎn)染后PROX 1蛋白和mRNA表達水平的比較

對照組與scramble siRNA組U118MG和U87MG細胞中PROX1蛋白和mRNA表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；PROX1 siRNA組U118MG和U87MG細胞中PROX1蛋白和mRNA的表達水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 各組 U118MG和 U87MG細胞中PROX 1 mRNA和蛋白表達水平的比較（±s）

2.3 細胞侵襲情況的比較

Transwell侵襲結(jié)果顯示，PROX1 siRNA組U118MG和U87MG細胞侵襲數(shù)目分別少于對照組和scrambled siRNA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表3）

表3 各組 U118MG和 U87MG細胞侵襲數(shù)目比較（±s）

2.4 細胞增殖情況的比較

MTT結(jié)果顯示，不同時間點scrambled siRNA組和對照組U118MG和U87MG細胞增殖能力比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在72、96 h，PROX1 siRNA組U118MG和U87MG細胞增殖能力低于scrambled siRNA組和對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表4）

表4 不同時間點各組 U118MG和 U87MG細胞增殖情況比較（±s）

2.5 PROX 1基因沉默對 U118MG細胞和 U87MG細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響

Western blot檢測U118MG和U87MG細胞中EMT標志蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PROX1 siRNA組U118MG和U87MG細胞中E-cadherin表達水平均明顯高于對照組，N-cadherin和Vimentin表達水平均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表5）

表5 對照組和PROX 1 siRNA組 U118MG和 U87MG細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達水平的比較（±s）

3 討論

近年來，隨著分子生物學(xué)研究的進步，尋求膠質(zhì)瘤生物學(xué)特性相關(guān)的分子靶點成為治療膠質(zhì)瘤新的突破點。本研究比較了A172、U87MG、U118MG、SHG-44和U251 5種人膠質(zhì)瘤細胞和正常人膠質(zhì)細胞中PROX1 mRNA和蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)U87MG和U118MG細胞PROX1表達顯著高于其他4種，故選擇此二者細胞為研究對象。PROX1基因是胚胎發(fā)育和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，與調(diào)控細胞周期和祖細胞分化密切相關(guān)。通過PROX1 siRNA沉默U87MG、U118MG細胞中PROX1的表達，MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)PROX1 siRNA組細胞生長能力降低，表明PROX1可促進膠質(zhì)瘤細胞增殖，提示PROX1可能影響膠質(zhì)瘤細胞的生長。

惡性膠質(zhì)瘤因其侵襲性強，易造成手術(shù)治療不徹底和復(fù)發(fā)。Transwell侵襲試驗發(fā)現(xiàn)PROX1低表達降低膠質(zhì)瘤細胞侵襲。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程極其復(fù)雜，EMT是腫瘤細胞浸潤和轉(zhuǎn)移的重要機制之一。既往相關(guān)研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中PROX1的表達量較癌旁組織降低，其機制可能為乳腺癌組織中PROX1基因自身轉(zhuǎn)錄沉默，同時其第一內(nèi)含子的CpG島呈高度甲基化，進而導(dǎo)致PROX1表達下調(diào)。并且在其與病理特征關(guān)系的研究中顯示，PROX1低表達與腫瘤細胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)，均提示其參與了腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。為研究PROX1對膠質(zhì)瘤細胞侵襲作用的機制，本研究檢測了EMT相關(guān)蛋白表達。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染PROX1 siRNA能顯著上調(diào)E-cadherin表達，下調(diào)N-cadherin和Vimentin表達，表明PROX1 siRNA加強腫瘤細胞黏附，降低細胞對周圍基質(zhì)侵襲。PROX1下調(diào)可能通過抑制EMT來抑制膠質(zhì)瘤細胞侵襲，提示下調(diào)PROX1基因在膠質(zhì)瘤細胞中的表達可能是抑制膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移的有效途徑，為膠質(zhì)瘤的抗轉(zhuǎn)移治療提供了實驗基礎(chǔ)。

目前已經(jīng)證實WNT、Notch和細胞外信號調(diào) 節(jié) 激 酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）/促分裂原活化的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）等多條信號通路參與膠質(zhì)瘤細胞轉(zhuǎn)移，但具體機制尚待進一步研究明確。此外，Risebro等發(fā)現(xiàn)，血液系統(tǒng)惡性腫瘤中由于PROX1基因沉默或基因突變導(dǎo)致PROX1表達下調(diào)，可能與PROX1基因的啟動子甲基化有關(guān)，同時提出PROX1基因沉默表達可抑制血液系統(tǒng)惡性腫瘤增殖。此觀點較為支持本研究結(jié)果。同時，受到樣本量較小及檢測方式單一化的影響，今后擬擴大樣本量并聯(lián)合多種檢測方式，以進一步探討PROX1影響膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移的機制。

綜上所述，PROX1在膠質(zhì)瘤細胞中高表達，可促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖，有望成為膠質(zhì)瘤基因治療的潛在靶點。