血管內皮生長因子、神經元特異性烯醇化酶及可溶性B7家族成員H4在小兒惡性淋巴瘤中的表達及診斷價值

李慧，劉晶

1西北婦女兒童醫院兒童血液腫瘤科，西安 710003

2寶雞市婦幼保健院兒童醫院兒童感染科，陜西 寶雞 721000

惡性淋巴瘤是起源于淋巴造血組織的一種實體腫瘤，以無痛性的淋巴結腫大為主要表現，可伴有發熱、消瘦等癥狀。惡性淋巴瘤可發生于任何年齡段，但近年來，小兒惡性腫瘤的發病率呈逐年上升趨勢。研究發現，淋巴瘤組織中存在多種異常增殖因子，如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、可溶性B7家族成員 H4（soluble B7 family member H4，sB7-H4）等。但目前國內有關VEGF、NSE及sB7-H4與小兒惡性淋巴瘤相關性的研究報道較為少見。因此，本研究檢測VEGF、NSE及sB7-H4在小兒惡性淋巴瘤中的表達情況，分析其對小兒惡性淋巴瘤的診斷價值，旨在為小兒惡性淋巴瘤的診治提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年6月至2020年12月西北婦女兒童醫院收治的惡性淋巴瘤患兒。納入標準：①符合惡性淋巴瘤的診斷標準；②未經正規治療，且近3個月內無藥物服用史；③臨床和隨訪資料完整。排除標準：①合并急性心梗死、腦出血等急性危重疾病；②合并凝血功能障礙；③合并重度脂肪肝、肝腎功能重度不全。依據納入和排除標準，本研究共納入54例惡性淋巴瘤患兒，其中男31例，女23例；年齡1～13歲，平均（6.48±1.13）歲；病理類型：霍奇金淋巴瘤19例，非霍奇金淋巴瘤35例；臨床分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期11例，Ⅲ期21例，Ⅳ期15例。取54例惡性淋巴瘤患兒的淋巴瘤組織和距腫瘤組織3 cm處的正常組織。

1.2 免疫組化法檢測VEGF、NSE及sB 7-H 4蛋白的表達情況

取54例惡性淋巴瘤患兒的淋巴瘤組織和距腫瘤組織3 cm處的正常組織，立即用10%甲醛固定，65℃烤片20 min后常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，阻斷滅活內源性過氧化物酶，置于pH=6.0的緩沖液中煮沸（95℃，15～20 min），自然冷卻20 min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次，每次5 min，進行抗原修復。滴加一抗4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min（用PBS代替一抗作為陰性對照，一抗稀釋比例均為1∶100）。滴加生物素標記的二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）/過氧化氫反應染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復染，常規脫水，透明，干燥，封片。

1.3 結果判定

VEGF主要定位于細胞質，NSE主要定位于細胞質或細胞核，sB7-H4主要定位于細胞質或細胞膜，根據陽性細胞所占比例和染色強度進行評分。陽性細胞所占比例：無陽性細胞為0分，＜10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分；染色強度：無著色為0分，淡黃色染色為1分，棕黃色染色為2分，棕褐色染色為3分。將陽性細胞所占比例評分和染色強度評分相乘，總分≥3分為陽性，＜3分為陰性。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 VEGF、NSE及sB 7-H 4表達情況的比較

惡性淋巴瘤組織中VEGF、NSE及sB7-H4陽性表達率均明顯高于正常組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同組織中VEGF、NSE及sB 7-H 4陽性表達情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征惡性淋巴瘤患兒淋巴瘤組織中VEGF、NSE及sB 7-H 4表達情況的比較

不同年齡、性別、病理類型和惡性程度惡性淋巴瘤患兒淋巴瘤組織中VEGF、NSE及sB7-H4陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期的惡性淋巴瘤患兒淋巴瘤組織中VEGF、NSE及sB7-H4陽性表達率均高于Ⅰ～Ⅱ期患兒，差異均有統計學意義（χ=7.422、6.400、7.269，P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征惡性淋巴瘤患兒淋巴瘤組織中VEGF、NSE及sB 7-H 4表達情況（n=54）

2.3 VEGF、NSE、sB 7-H 4單獨及聯合檢測對小兒惡性淋巴瘤的診斷價值

ROC曲線結果示，VEGF、NSE、sB7-H4單獨檢測診斷小兒惡性淋巴瘤的AUC分別為0.632、0.731、0.674，VEGF+NSE+sB7-H4聯合檢測的AUC為0.805，明顯高于單獨檢測。（表3、圖1）

圖1 VEGF、NSE、sB 7-H 4單獨及聯合檢測小兒惡性淋巴瘤的ROC曲線

表3 VEGF、NSE、sB 7-H 4單獨及聯合檢測對小兒惡性淋巴瘤的診斷價值

3 討論

目前有關惡性淋巴瘤發病機制尚未明確，可能與環境、感染等有關。近年來，惡性淋巴瘤的發病率呈逐年上升和年輕化趨勢，對患者身心健康可造成一定影響，早期診斷治療對改善惡性淋巴瘤患者的預后有重要意義。因此，本研究探討VEGF、NSE及sB7-H4在小兒惡性淋巴瘤中的表達情況，旨在為惡性淋巴瘤的早期診斷治療提供參考。

VEGF又稱為血管通透因子，具有增加促進血管通透性、促進細胞增殖和腫瘤新生血管生成等作用。本研究結果顯示，42.59%的惡性淋巴瘤組織中VEGF表達陽性，高于正常組織；且臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期的惡性淋巴瘤患兒淋巴瘤組織中VEGF陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期患兒，表明VEGF的表達可能與惡性淋巴瘤的進展有關。但Navone等的研究發現，VEGF表達與惡性淋巴瘤病理類型、年齡有關，與本研究報道不符，這可能與納入病例數不同、地域差異等有關。

NSE是一種普遍存在于哺乳動物中的糖酵解酶。目前，NSE主要作為神經系統損傷與小細胞肺癌的標志物。但隨著研究的不斷深入，已有多項研究報道了NSE與惡性淋巴瘤的關系。Oya等研究發現，NSE在小兒惡性淋巴瘤中的陽性表達率高于健康對照組。與本研究結果相符，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期的惡性淋巴瘤患兒淋巴瘤組織中NSE陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期患兒。表明NSE在惡性淋巴瘤發生、發展中有重要作用，可作為病情監測、療效評估的有效指標。

B7-H4是一種新型的協同刺激分子。Podojil等研究發現，B7-H4以可溶性的形式分布于腫瘤患兒血清中。人B7-H4基因的mRNA大量分布于淋巴組織與非淋巴組織中，但其蛋白則不表達于大部分正常組織中。國內外研究發現，B7-H4在肝癌、胃癌等多種惡性腫瘤中高表達，且其表達上調與患兒的臨床分期密切相關。本研究結果發現，與正常組織相比，淋巴瘤組織中sB7-H4的陽性表達率更高，且臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期的惡性淋巴瘤患兒淋巴瘤組織中sB7-H4陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期患兒。表明sB7-H4有望成為新的惡性淋巴瘤監測的腫瘤標志物。

Katagiri等研究指出，部分因子可作為惡性淋巴瘤診斷、病情評估、疾病進展的敏感生物標志物。但國外相關研究發現，單一因子檢測易造成誤診或漏診，多主張多項指標聯合檢測。本研究通過ROC曲線分析結果顯示，VEGF、NSE及sB7-H4單獨檢測均可有效診斷惡性淋巴瘤，但聯合檢測診斷小兒惡性淋巴瘤的AUC最大，與上述文獻報道相符。但本研究納入的樣本量較小，有可能存在一定偏差，尚需要更大樣本量、多中心的研究證實。

綜上所述，VEGF、NSE及sB7-H4在惡性淋巴瘤中呈異常表達，三者聯合檢測并結合臨床特征有助于提高惡性淋巴瘤的診斷效能。