小動物可見光活體成像技術在醫學研究生技能教學中的應用

盧宏濤　劉蘇　韓玲　沈慧

【摘要】小動物可見光活體成像技術是一項技術應用廣、實用性強的生物醫學研究手段，但由于實驗設備要求高，相關儀器貴重，目前尚缺乏相關課程應用到研究生技能教學中。本課程利用國家級教學實驗平臺，系統性地針對醫學研究生開展了小動物活體成像技術應用與操作這門課程，利用16個理論學時，14個實踐學時全面系統地完成課程教育，最終達到研究生能夠獨立熟練地完成相關實驗技能。

【關鍵詞】小動物活體成像? 技能培訓? 研究生教學

【基金項目】海軍軍醫大學重點課程建設項目“小動物活體成像技術與應用”。

【中圖分類號】G64? 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-3089（2021）07-0014-02

小動物可見光活體成像技術是采用生物發光與熒光兩種方式，利用高靈敏度的光學檢測儀器直接檢測動物活體體內的細胞活動和基因行為，利用該技術可以檢測活體動物體內腫瘤的生長和轉移、炎癥的發生、特定基因的表達和藥物研究、細胞凋亡及流行病學等領域的研究。但由于小動物可見光活體成像設備稀缺貴重，在高校的研究生課程中一般不設立該課程的理論和技能教學。然而，隨著生物醫學研究的深入與發展，小動物可見光活體成像技術在科學研究中的應用越來越普遍，已成為一項常規的生物實驗技術手段。所以本課程通過利用國家級教學實驗中心的平臺設備，開展技術應用廣泛、實用性強的小動物可見光活體成像技術的研究生技能教學。

目前，高等院校利用自身已有平臺開展具有實踐價值，能夠快速促進研究生投入科研工作的技能教學課程已成為一項重要的研究生培養教育改革內容。實驗技能是醫學研究生不可缺乏的基本技能，在研究生課程學習階段推廣深入技能實踐培訓有利于研究生快速進入科研狀態。小動物可見光活體成像技術的技能教學應用到研究生培養中，對高校研究生教育培養有積極的推動作用。

一、材料與方法

1.儀器設備

Bio-Real公司的Quickview 3000小動物活體成像系統;ESCO公司的細胞培養箱;BIOBASE公司的生物安全柜。

2.實驗試劑與材料

免疫缺陷裸鼠購于上海杰思捷實驗動物有限公司;熒光素鉀鹽購于上海碧云天生物技術有限公司;腫瘤細胞株購于上海研酶生物科技有限公司;細胞培養基購于上海雁金生物科技有限公司。

3.實驗步驟

步驟1：目標基因及熒光素酶基因或者熒光蛋白基因導入到實驗需要的細胞內。可以將學生分成兩組，一組學生使用熒光素酶標記的細胞株，另一組學生使用熒光蛋白標記的細胞株，讓學生在后續實驗中了解兩種方法的特點和差異。

步驟2：篩選出穩定表達熒光素酶或者熒光蛋白的細胞。步驟1和步驟2根據課時要求可以讓學生使用已經構建好的細胞株。將準備好的細胞株復蘇，擴增，根據細胞數量將細胞以不同數量種于96孔板內，貼壁后利用小動物活體成像儀確定能夠檢測的細胞量閾值。

步驟3：細胞擴增到足夠量之后，將細胞消化，使用培養基重懸后計數（可以讓學生學習細胞計數的方法），按照每個部位107細胞量接種腫瘤細胞，荷瘤小鼠一般選用免疫缺陷的裸鼠，荷瘤部位一般選擇軀干兩側接近腋下的部位，荷瘤時注意注射器穿刺的深淺，以形成表皮的皮丘為宜。

步驟4：腫瘤細胞接種一周后，基本可以肉眼觀察到腫瘤的生長，可以定期使用Bio-real小動物成像儀觀察荷瘤小鼠腫瘤的大小以及生長情況。

步驟5：準備好待測小動物、實驗材料，并稀釋螢光素鉀鹽溶液至工作濃度。

步驟6：打開小動物活體成像儀及電腦，打開軟件，點擊生物發光模式，在此期間CCD會降溫至-80℃。在降溫時，向麻醉泵中注入適量異氟烷，調節麻醉劑和氧氣閥門，麻醉劑調至2刻度，氧氣調至3刻度，打開控制麻醉劑的三通管閥門，使小動物麻醉箱中充入異氟烷。

步驟7：將適量螢光素鉀鹽注入（尾靜脈/腹腔）到小鼠體內后，控制好時間，一般腹腔注射15min后，將小鼠放入到麻醉箱中，進行誘導麻醉。（如果是熒光蛋白無需此操作）

步驟8：小鼠麻醉后，打開通向成像系統的麻醉管閥門，打開麻醉盒取出小鼠，將小鼠放入到觀察位置上，并將小鼠嘴部對準麻醉孔，同時將小鼠擺出適宜觀察的姿勢，關閉通向麻醉盒的閥門，關閉儀器封閉門。

步驟9：打開focus按鈕，觀察小鼠放置情況，調整視野的大小，打開平臺控溫板，保證小鼠在37℃條件下維持體溫。打開生物發光，設置曝光時間（一般30～60s）、放大倍數（超過500則沒有意義）。

步驟10：點擊start，開始測定，也可選擇連續曝光。

步驟11：在得到的圖像上，可觀察得到數據，進入軟件分析系統，自動或手動計算發光強度。點擊export，保存圖像及數據到固定文件夾。

步驟12：關閉儀器前，點擊cool off，使CCD升溫到0℃以上方可關閉儀器及電腦。

二、實驗原理

1.熒光成像原理

熒光物質的分子在受到能量的激發后，其核外電子從基態躍遷到激發態，而激發態的電子處于高能量狀態，并不穩定，其可以通過釋放光子的形式回到基態，在這個過程中發射出的光子稱之為熒光。不同的物質的激發光和發射光的廣譜有所不同，需要檢測的設備具備相應的濾光片。熒光物質被激發后所發射的熒光信號的強度在一定范圍內是與熒光素存在的量成線性關系的，這是熒光成像系統應用于生物學研究的理論基礎。

2.生物發光的原理

將螢光素酶基因整合到細胞的基因組當中去，讓細胞可以穩定表達螢光素酶，當外源性的給與細胞或者動物螢光素酶的底物時，同時在細胞中ATP的參與下，螢光素酶催化底物與ATP發生化學反應產生光子，稱之為生物發光。發光的強度與標記的細胞數量呈線性關系，通過檢測發錯生物光的強度來評價細胞的數量水平。

3.生物發光和熒光成像的特點

生物發光和熒光成像有各自的優勢和缺點，與熒光成像技術相比較，生物發光成像技術主要的優勢有信號特異性強，不存在本底自發光的干擾;靈敏度高，可以檢測102的細胞量;精準定量，單位細胞的發光數量穩定。而相對于生物發光成像技術，熒光成像技術的優勢主要表現在應用范圍廣，熒光標記物種類繁多且可多重標記;信號強度大，激發光能量轉移保證信號強度;低毒性成本，無需注射底物且成本低;商業可獲得性，成熟的商品性熒光標記物選擇多;樣本要求低，基于能量轉移而無需考慮生物是否存活。

三、實例說明：利用小動物活體成像技術評價藥物抗腫瘤作用

1.熒光素酶標記腫瘤細胞的構建

將獲得的Hela腫瘤細胞接種至24孔細胞培養板當中，接種細胞量為105/孔，24h后觀察細胞狀態，確定細胞生長正常后進行熒光素酶質粒的轉染。轉染試劑使用Lipofectamin 2000，具體操作步驟及試劑使用量參照說明書。將細胞分為空載體組和熒光素酶基因轉染組，每組細胞設置3個復孔重復。轉染后48h，觀察細胞狀態以及細胞的密度，細胞長滿后按照1∶5的比例進行傳達。轉染質粒帶有嘌呤霉素抗性基因，因此加入嘌呤霉素對未轉染成功的細胞進行篩選，從而獲得陽性細胞。擴張帶熒光素酶基因的陽性Hela細胞，并按照倍比稀釋的原理檢測熒光素酶活性。

2.荷瘤小鼠模型構建

將擴增好的Hela腫瘤細胞，按照實驗要求種于裸鼠的皮下或者其他臟器，細胞量在1×107左右，皮下荷瘤時注意荷瘤的深度，不易過深，以形成小皮丘為準。設立荷瘤組和藥物治療組（可讓學生選擇一種治療藥物），每組6只小鼠，小鼠在荷瘤一周后，讓學生觀察肉眼下腫瘤的生長情況，對比治療組和荷瘤組腫瘤大小以及小鼠的一般狀況。

3.荷瘤小鼠活體腫瘤檢測

D-螢光素鉀鹽的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細胞膜和血腦屏障，在體內擴散速度快，可通過腹腔注射或尾靜脈注射進入動物體內。腹腔注射或尾靜脈注射時，按照10μl/g的體重濃度，向小鼠體內注射螢光素鉀鹽溶液，如20g的小鼠，注射200μl共3.0mg D-螢光素鉀鹽。小鼠腹腔注射熒光素酶底物D-螢光素鉀鹽后，利用異氟烷在小動物氣體麻醉箱內麻醉，調整好適當的麻醉劑和氧氣的流量。在此期間做好設備的開機與CCD預冷準備，調至生物發光模式，打開小動物恒溫平臺，調整好視野。注射入體內10～20min后，待螢光信號達到最強穩定平臺期，再用適當儀器進行成像分析。待小鼠完全麻醉后將其移入檢測箱內，小鼠口鼻對準麻醉氣孔，關閉檢測箱門，確定密封性，可使用連續曝光模式確定最佳曝光時間，初始可曝光30s，放大倍數100。

4.實驗數據處理

完成曝光后，觀察腫瘤部位的信號強度，調整信號的最大最小的閾值，以腫瘤細胞易于觀察且具有區分度為宜，一般而言，腫瘤中心的腫瘤細胞最多光強度最大，周圍呈現遞減的趨勢，但有時如果腫瘤生長過快，腫瘤中心細胞壞死，則會導致中間信號弱。小動物活體成像圖像處理軟件除了提供含有光子強度標尺的成像圖片外，還能計算分析發光面積、總光子數、光子強度的相關參數供實驗者參考。在分析界面中可選擇自動選擇或者手動選擇信號圖像范圍。

四、實驗影響因素

1.成像過程中的曝光時間，曝光時間過長則非特異性雜信號比較多;時間過短，信號太弱無法有效觀察目前信號。為保證每只實驗樣本之間具有可比性，同一批實驗需要保持曝光時間及放大倍數一致。

2.動物品系的選擇也會對實驗造成影響，普通小鼠因為帶有皮毛，本身對于光子的穿透具有阻礙作用，因此一般選擇裸鼠。另外，熒光模式下，小鼠的毛發會具有熒光特性，從而干擾實驗的觀察。

3.熒光成像時，需要選擇背景低的材料放于動物身體下，可以選擇放置黑色的紙板，從而減小背景的干擾。

4.熒光蛋白的特性會影響實驗的效果，一般而言，波長越長，熒光的穿透力就越強，越容易透過小鼠皮毛被檢測到;綠色熒光蛋白波長較短，不適宜小鼠的活體成像。

5.注射螢光素酶底物的方式與時間會影響生物發光的信號強弱，理論上尾靜脈注射發光強度到達峰值的時間要短于腹腔注射，同時發光強度到到峰值之后會出現衰減的情況，因此，同一批實驗在保障注射方式一致的情況下，還應控制注射后到檢測的時間一致。

五、結論與分析

本研究生課程共計30個學時，其中理論學時16個，實踐學時14個，課程對包括活體成像技術的發展、原理、特點與實例操作等進行了全面、具體、系統的教學。教學過程中涉及實驗方法的選擇、實驗的設計、實驗的技術、儀器設備的操作以及最后結果的呈現等各方面的環節，讓研究生既能學到理論知識，又能掌握具體的操作，并獲得更多的參與感。小動物活體成像技術應用與操作研究生課程的實施推動了醫學類高校針對研究生技能培訓的教學改革。

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作者簡介：

盧宏濤（1990年10月-），男，助教，醫學碩士，主要從事預防醫學相關教學與科研工作。

沈慧（1977年1月-），男，教授，醫學博士，主要從事預防醫學相關教學與科研工作。