QuEChERS/氣相色譜－串聯質譜法測定乳制品中232種農藥殘留

王 敬，張海超，陳敏娜，艾連峰，張亦琴

（石家莊海關技術中心，河北 石家莊 050051）

乳制品是高營養食品，不僅含有豐富的脂肪、蛋白質和碳水化合物，還含有人體必需的維生素和微量元素，已成為人們日常消費最多的食品之一。而乳制品中農藥殘留是影響乳品安全的因素之一，尤其乳制品產業鏈長，農藥殘留可通過食物鏈蓄積，進而對人體造成長期、微劑量及慢性細微毒性效應。這種毒性效應起病緩慢、持續期長、涉及面廣、影響人數多，可在人體生理、自身免疫功能、致癌、致畸及致突變等方面反映出來［1－4］。乳品中農藥殘留主要是因為奶牛進食了被農藥污染的飼料，或在使用殺蟲劑控制奶牛身上的真菌、細菌、線蟲等及周圍的蒼蠅、蚊蟲時混入奶中，擠奶設備、用具及其它牛奶接觸到的物品也均可能產生殘留。我國以及歐盟、日本、美國和中國香港等國家和地區不斷修訂乳及乳制品中殺蟲劑、除草劑和殺菌劑等農藥的最高殘留限量（MRLs）。其中，中國香港《食物內除害劑殘余規例》制定了牛奶中142種農藥殘留限量；歐盟制定了乳品中460多種農藥殘留限量；美國制定了牛奶中190余種農藥殘留限量；澳大利亞制定了牛奶中227種農藥殘留限量；日本制定了牛奶中373種農藥殘留限量［4］。2020年2月15日實施的GB2763－2019《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》［5］規定了109種農藥在肉、蛋、奶等動物源性農產品中的703項農藥最大殘留限量，其中殺撲磷低至0.001 mg/kg，七氯和艾氏劑均為0.006 mg/kg，嘧菌環胺更是低至0.0004 mg/kg。

近年來，我國有關機構對于乳制品中農藥殘留的監管力度不斷加大。已頒布的GB23200.86－2016、GB23200.90－2016和GB23200.85－2016［6－8］等國家標準大多只檢測一種或一類農藥殘留，覆蓋范圍窄；GB/T23210－2008［9］雖然涉及農藥面廣，但前處理方法較為繁瑣，基質單一，且由于采用GC－MS測定，許多農藥的檢出限無法滿足GB2763－2019的限量要求。為了更好地滿足市場需求，乳制品中農藥多殘留快速檢測的方法研究已逐漸成為熱點。乳制品組成成分較多，主要的基質干擾成分有脂肪、磷脂、蛋白質、糖類等，常用液液萃取法、凝膠滲透法、固相萃取法、低溫冷凍除脂法和QuEChERS法等前處理方法［4，10－15］。其中，QuEChERS法具有操作簡單、快速、實用、高效等優點，可滿足快速處理大批量農藥殘留樣品的需求。

GB2763－2019國家強制性標準自發布以來，對食品行業從種植（養殖）、加工直至餐桌消費整個閉環產生了巨大影響。已有文獻研究了牛奶中農藥殘留，但對GB2763－2019規定的乳制品中農藥殘留分析研究尚未見報道。本文在前期研究基礎上［4］，對GB2763－2019中涉及的多數農藥進行了分析研究，涉及農藥種類占全部總限量數的54%。采用具有較好選擇性和靈敏度的氣相色譜－質譜/質譜儀結合QuEChERS凈化技術，并優化前處理方法和儀器上機條件，建立了氣相色譜－串聯質譜法同時檢測乳制品中232種農藥多殘留的分析方法，為推進乳品中農藥殘留相關檢測標準的制定提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

TRACE1310－TSQ8000Evo氣相色譜三重四極桿串聯質譜儀、TG－5SilMS氣相色譜柱（30mm×0.25 mm×0.25 μm）（美國Thermo Fisher Scientific公司）；電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Turbo Vap LV型氮吹濃縮儀（Zymark公司）；ALLEGRA X－15R型離心機（美國Beckman公司）；Milli-Q純化系統（Millipore公司）。

232種農藥標準物質及環氧七氯內標（Dr.Ehrenstorfer和Sigma公司）；乙腈、乙酸、丙酮、正己烷均為色譜純（美國Dikma公司）；無水硫酸鎂（分析純，廣州化學試劑廠）；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷（C18）、石墨化炭黑（GCB）購自美國Dikma公司。

供試樣品：牛奶、羊奶、奶粉、酸奶、原料奶和奶酪采購于本地市場。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 標準儲備液的配制：稱取約5～10mg（精確至0.1 mg）各農藥標準品分別置于10mL容量瓶中，根據各物質的溶解性選用甲苯或丙酮溶解并定容至刻度，于－20℃冰箱中保存。混合標準溶液的配制：移取一定量各農藥標準儲備液于100mL容量瓶中，用丙酮－正己烷（體積比1∶1，下同）定容并配成100μg/mL的混合標準工作液，于－20℃冰箱中保存。內標溶液：準確稱取環氧七氯（內標），用丙酮－正己烷（1∶1）逐級稀釋成20μg/mL的內標溶液，于－20℃冰箱中保存。基質空白標準溶液：準確吸取適量混合標準工作液，用樣品空白提取液配成系列基質空白標準溶液，現用現配。

1.2.2 樣品前處理 液體乳制品：稱取試樣約10g（精確至0.01 g）于50mL離心管中，準確加入15mL1%乙酸乙腈、6g無水硫酸鎂、1.5 g無水醋酸鈉及1顆陶瓷均質子，劇烈振蕩1min后以5000r/min離心5min，吸取5mL上清液加入內含900mg無水MgSO4、50mg C18和50mg PSA的離心管中，渦旋混勻1min，以5000r/min離心5min。準確吸取3mL上述離心后的上清液于10mL試管中，于40℃氮氣吹至近干，用丙酮－正己烷（1∶1）定容至1mL，加入10μL內標溶液，超聲溶解30s，過0.22 μm有機相濾膜，待測定。

固體乳制品：稱取試樣5g（精確至0.01 g）于50mL離心管中，加入10mL40～45℃水重復溶解并浸泡30min，再加入15mL1%乙酸乙腈、6g無水硫酸鎂、1.5 g無水醋酸鈉及1顆陶瓷均質子，劇烈振蕩1min后以5000r/min離心5min，吸取5mL上清液加入內含900mg無水MgSO4、50mg C18和50mg PSA的離心管中，渦旋混勻1min，以5000r/min離心5min。準確吸取3mL上述離心后的上清液于10mL試管中，于40℃氮氣吹至近干，用丙酮－正己烷（1∶1）定容至1mL，加入10μL內標溶液，超聲溶解30s，過0.22 μm有機相濾膜，待測定。

1.2.3 氣相色譜條件 色譜柱：TG－5silMS氣相色譜柱（30mm×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：50℃保持1min，以30℃/min升至130℃，再以6℃/min升至280℃，最后以10℃/min升至310℃，保持5min；載氣：高純氦氣（純度≥99.999 %）；流速：1.30 mL/min，恒流；進樣口溫度：290℃；進樣量：1μL；進樣方式：不分流進樣，1.5 min后打開分流閥。

1.2.4 質譜條件離子源：電子轟擊源（EI）；離子源溫度：250℃；四極桿溫度：150℃；GC－MS/MS接口溫度：280℃。溶劑延遲時間：10min；碰撞氣為氬氣，流速1.5 mL/min，猝滅氣為氦氣（He），流速2.25 mL/min。多反應離子監測模式（T－MRM），每個農藥選取2對特征MRM反應，其中一個作為定量離子對，一個作為定性離子對。

2 結果與討論

2.1 提取條件的優化

由于考察農藥覆蓋了有機磷、有機氯、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、雜環類等極性和溶解度差異較大的多種類農藥，要求提取溶劑對目標物具有足夠的溶解性和穩定性。因此，實驗比較了乙腈、丙酮、丙酮+乙酸乙酯、丙酮+正己烷4組試劑對232種農藥的提取效率（表1）。結果發現：用丙酮、丙酮+正己烷提取時，部分農藥回收率低；用丙酮+乙酸乙酯提取時，脂溶性雜質較多，提取液顏色較深，不利于后續凈化。乙腈滲透性強，適用于提取極性范圍較寬的農藥，對乳制品中脂類雜質提取效率低，并可迅速沉淀蛋白，對于牛奶、羊奶等含水量較高的樣品可直接提取；但對于含水量較低的乳粉等樣品，采用乙腈直接提取時的平均回收率低于60%，因此需在提取前加水浸泡，促使樣品溶脹，提高提取效率；同時加入乙酸酸化，避免百菌清、異菌脲、苯線磷等堿性或中性環境下不穩定農藥的降解和損失［16］。由于百菌清結構式中的甲腈基團與樣品基質相互作用［17］，導致回收率偏低，加入少量乙酸可破壞這種作用力，從而提高回收率。實驗考察了乙酸體積分數分別為0.5 %、1%、2%、5%對目標物提取效率的影響。結果發現：當乙酸體積分數為0.5 %時，目標物的提取率偏低，當乙酸體積分數為1%、2%和5%時均可獲得較高的提取率，但隨著乙酸體積分數的增加，其他共萃取質子化的概率也會增加，不利于樣品凈化。因此，選取1%乙酸乙腈為提取溶劑。采用渦旋混勻提取乳粉樣品時，難以破壞蛋白沉淀層致使提取不完全，且無水硫酸鎂遇水易結塊，加入陶瓷均質子可避免無水硫酸鎂結塊影響除水效果和消除因沉淀包裹目標物造成的回收率降低。陶瓷均質子兩側為斜切面的圓柱體，可在振蕩過程中通過剪切力將樣品和結塊的無水硫酸鎂進一步切碎混勻，增大了樣品和提取溶劑的接觸面積，提高了提取效率。

表1 不同提取溶劑對牛奶中232種農藥的添加回收率統計（n=3）Table1 Spiked recoveries of232pesticides in milk extract with different extraction solvents（n=3）

2.2 凈化條件的優化

乳及乳制品基質比較復雜，含有大量脂肪、蛋白質和磷脂，乳粉中還含有大量的糖，且方法涉及農藥種類及數量較多，因此需去除蛋白質、脂肪等干擾物［17］。盡管脂肪不溶于乙腈提取劑，但提取過程中仍會攜帶出少量脂肪。QuEChERS方法常用的凈化劑有PSA、C18、GCB、無水MgSO4等。無水MgSO4可以去除提取液中的水分，但提取后直接加入會立即劇烈放熱，不利于熱不穩定農藥的檢測，加完后立即劇烈振蕩可減少結塊和放熱對提取效率的影響。PSA可去除樣本基質中的脂肪酸、糖等極性雜質，C18能吸附基質中部分非極性脂肪和脂溶性雜質，GCB能夠去除色素和固醇類雜質，但對百菌清、六氯苯等平面結構的農藥具有一定的吸附［18］，實驗參考了食品安全國家標準GB23200.113－2018［19］，對凈化步驟進行了優化，最終選定PSA、C18和無水MgSO4為凈化劑。考察了不同配比的PSA和C18的凈化效果。取1.5 mL提取液，固定加入20mg PSA，分別比較了C18添加量為10、30、50、70mg對回收率的影響，發現C18添加量為50mg時各農藥的回收率最高；固定加入50mg C18，分別比較了PSA添加量為10、30、50、70mg對回收率的影響，發現PSA添加量為50mg時各農藥的回收率最高。因此，實驗最終選擇向提取液中加入900mg無水MgSO4、50mg C18和50mg PSA，并立即渦旋振蕩1min。

2.3 質譜條件的優化

對232種農藥的混合標準溶液在m/z30～500范圍內進行全掃描，使用NIST標準庫匹配檢索，確定目標物的保留時間，并對目標物的前級離子、產物離子、碰撞能量等一系列質譜參數進行了優化。與傳統的多反應監測模式（MRM）相比，T－MRM可對每種組分的保留時間窗口進行動態分配，檢測多種目標物無需分時間段，可簡化分析流程，提高分析效率，適合進行農藥多殘留分析。圖1為優化條件下232種農藥的總離子流（TIC）圖。

圖1 232種農藥混合標準溶液的TIC圖Fig.1 TIC chromatogram of232pesticides in two groups

2.4 內標的選擇

為了提高方法的準確度、保持良好的重復性，盡可能地減少或消除儀器操作條件造成的系統誤差，以及消除EI源在離子化過程中的變化，采用內標法定量。內標應與待測組分基本相同或盡可能一致的物理化學性質，在分析過程中有良好的穩定性，且具有較高的質譜響應。實驗考察了環氧七氯、多氯聯苯（PCB198）、磷酸三苯酯作為內標對定量的影響。結果發現，以環氧七氯為內標時效果最好，且具有很好的穩定性和較高的質譜響應［9，19－22］，因此選擇環氧七氯為內標進行定量分析。

2.5 基質效應

基質效應（ME，%）=（基質匹配標準曲線的斜率/純溶劑標準曲線的斜率－1）×100%，ME小于20%為弱基質效應；ME在20%～50%范圍內為中等基質效應；ME大于50%為強基質效應［23－24］，232種農藥在不同乳品中的基質效應結果如圖2所示。由圖可見，不同樣品基質中，至少有60%的分析物響應信號增強，固體乳品中農藥的基質效應普遍大于液體乳品，其中，奶粉基質對31%的農藥表現為強基質效應，即72種農藥的ME均大于50%。這是由于同一目標物在不同基質中基質效應的大小不同所致，因此需使用與測定樣品基質相一致的基質匹配標準溶液進行校正。由于基質效應的產生原因復雜、來源多樣，因而難以根本去除基質效應的影響［25］。目前，減少基質效應影響的方法一般有加入同位素標記的目標物，增加凈化步驟或進樣前稀釋，基質匹配標準溶液，分析物保護劑的加入等［4，26－28］。本方法采用基質匹配標準溶液進行測定，能夠很好地解決峰形較寬，保留時間漂移的問題，基本抵消了基質效應的干擾。

圖2 232種農藥（20μg/kg）在不同乳品中的基質效應Fig.2 Matrix－effects of232pesticides（20μg/kg）in different milk products

2.6 線性關系、定量下限、回收率及相對標準偏差

實驗選取空白牛奶、羊奶、奶粉、酸奶、原料奶和奶酪樣品基質的提取液（按“1.2.2”方法制備），配制不同質量濃度的農藥基質標準溶液，以環氧七氯為內標，進行線性回歸。結果表明，嘧菌環胺在0.2 ～4.0 μg/L，殺撲磷、氯丹、六六六和滴滴涕在0.5 ～10.0 μg/L，丙硫菌唑、七氯、艾氏劑、苯線磷、狄氏劑、異狄氏劑在1.0 ～20.0 μg/L，百菌清在20～400μg/L，其余212種農藥在5～100μg/L范圍內呈線性關系，相關系數（r）均大于0.99。按照組分的T－MRM離子峰信噪比S/N≥10，得到乳制品中232種農藥的定量下限（LOQ）為0.0004 ～0.05 mg/kg，除百菌清LOQ為0.05 mg/kg，其他農藥LOQ均不高于0.01 mg/kg，滿足GB2763－2019的限量要求。

在陰性牛奶樣品中分別添加0.01 、0.02 、0.10 mg/kg的232種農藥混合標準溶液，靜置30min，待農藥被樣品充分吸收后，按“1.2.2”方法處理并進行回收實驗，每個添加水平重復6次，計算相對標準偏差（RSD），結果見表2。結果表明，232種農藥在牛奶中的平均回收率為65.2%～110%，RSD為3.6 %～13%，完全滿足國內外對乳品檢測的要求。

表2 232種農藥的保留時間、離子對、相關系數（r）、定量下限（LOQ）、平均回收率及相對標準偏差（n=6）Table2 Retention times，characteristics ions，correlation coefficients（r），LOQs，average recoveries（R）and RSDs（n=6）of the232pesticides

(續表2)

(續表2)

(續表2)

(續表2)

2.7 實際樣品檢測

將建立的方法應用于市售280批次乳制品（包括90批次原料奶、70批次牛奶、10批次羊奶、62批次酸奶、40批次奶粉和8批次奶酪）中232種農藥殘留的監測，結果在4份原料奶檢出六六六，含量為1.7 ～7.6 μg/kg，7份原料奶檢出滴滴涕，含量為1.3 ～4.8 μg/kg，其它農藥均未檢出。根據GB2763－2019奶中六六六和滴滴涕的殘留限量均≤0.02 mg/kg，表明二者殘留量較低，未超過國家衛生標準限值。

由于有機氯農藥被降解需30年之久，原料乳中仍偶有檢出，因此，乳品中農藥殘留仍需得到足夠重視，進行長期監測。

3 結 論

本文對乳制品中農藥多殘留的前處理方法和檢測技術進行了深入研究，采用QuEChERS法結合氣相色譜－串聯質譜建立了一種簡單、快速、高效且能同時準確定性和定量檢測乳制品中232種農藥殘留的方法。該方法涵蓋農藥種類全，同時對不同種類的樣品基質進行考察，進一步加強了方法的適用性，且定量下限同時滿足國家標準和歐盟等國家和地區的檢測要求，為乳制品的日常檢測提供了有力的技術支持。