黃三素鏈霉菌15-6發酵液的抑菌活性研究

張雨陽，魏有海，郭良芝，程 亮，朱海霞，郭青云

（青海大學農林科學院，青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室，青海 西寧 810016）

植物病害是降低農業生產能力的因素之一，其中植物病原真菌可以引起葉斑病、穗腐病、根腐病、霉變、種子變色等嚴重病害，造成嚴重的經濟損失；不僅如此，有些植物病原真菌也會導致人畜疾病[1-2]。使用化學藥劑防治植物病害會引起很多副作用，因此生物防治由于副作用小而逐漸成為農業生產的發展新趨勢。鏈霉菌具備寬泛的抗菌能力，可以產出多種活性物質，如植物激素、抗生素等。這些物質不僅可以增加植物的抗逆性和抗病性，還可作為生物農藥進行開發利用[3-4]。以求進一步將該菌株得用于試劑生產，在差別條件下對該菌株發酵液的抗菌活性和穩定性進行研究，為后續開發該菌株作為生物農藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養基

青海省農業害蟲綜合治理重點實驗室保存黃三素鏈霉菌15-6和12種病原菌。

Gao’s No.1培養基：可溶性淀粉 20.0 g，KNO30.5 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1 L，pH值7.4～7.6。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯 200 g,葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，自然pH值。

1.2 鏈霉菌15-6無菌發酵液的制備

將活化菌株15-6接種于Gao’s No.1發酵培養基，以180 r/min在28℃條件下利用搖床搖勻，恒溫條件下培育5 d， 收集發酵液，將發酵液以10 000 r/min的速度離心30 min，收集上清液，用0.22 μm 濾膜過濾，制備無菌發酵濾液完成。

1.3 抑菌譜測定采用生長速率法

取菌株15-6無菌發酵濾液1 mL加入到直徑9 mm的培養皿中，與冷卻至 50 ℃的9 mL PDA 培養基混勻制成帶毒平板，用無菌打孔器打取5種病原菌菌餅（直徑為 5 mm），菌苔向下放置于帶毒平板的中央，以無菌水與PDA制成的平板為對照。28 ℃條件 下培養，記錄櫻桃葉斑病菌的菌落直徑，7 d后用十字交叉法測量菌落直徑并按公式（1）計算抑菌率。

抑菌率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌餅直徑）×100% （1）

1.4 檢測拮抗菌株發酵液的熱穩定性

1.4.1 熱穩定性 在60、80和100℃的不同條件下，將菌株15-6無菌發酵濾液分別處理30和60 min，而后在121 ℃條件下滅菌20 min，CK為未經溫度處理的發酵液，按方法1.3用生長速率法測定其對芒果膠孢炭疽菌的抑菌活性。

1.4.2 酸堿穩定性 pH值設為 1.0～13.0間等間隔的13個梯度，菌株15-6無菌發酵液的pH值用HCI 和NaOH溶液進行酸堿度調節，靜置24 h后，調回發酵液的原始酸堿度（pH值= 7.2），測定菌株15-6無菌發酵液對芒果膠孢炭疽菌的抑菌率。

1.4.3 酶穩定性 酶的最終濃度是50 mg/L，把溫度設定為37℃。用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K分別處理菌株15-6發酵液0.5、1.0、1.5和2.0 h。通過測定菌株15-6無菌發酵液對炭疽菌的抑制效果，獲得對蛋白酶的耐受性。

1.4.4 對紫外線穩定性進行測定 將菌株15-6發酵液用紫外燈照射10、20、30、40、50、60 min，使用功率為30 W的紫外燈，照射距離為30 cm。測定菌株15-6無菌發酵液對芒果炭疽菌的抑菌率。

1.4.5 重金屬離子的穩定表現 在無菌濾液中加入NaCl、KCl、CaCl2和FeCl3溶液，直至金屬離子濃度達到0.05 mol/L，以不含金屬離子的無菌濾液為對照，測定菌株15-6無菌發酵液對芒果炭疽菌的抑制率。

1.5 菌株15-6的鑒定

形態學及培養特性觀察：菌株15-6接種于Gao’s No.1培養基，將滅菌后的蓋玻片斜插于培養基中。培養7 d，28℃ ，取蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌絲和孢子鏈的形態特征，在PDA培養基上接種該菌株，之后在溫度為28℃的條件下持續培養8～15 d，在此期間，觀察菌絲和氣生菌絲的生長情況及可溶性色素的產生與否。

生理生化特性測定：參照《鏈霉菌鑒定手冊》測定菌株的明膠液化、淀粉水解、纖維素分解、過氧化氫酶、硝酸鹽還原及生長溫度等各項試驗[5-6]。

菌株16S rRNA分子鑒定：采用CTAB法提取基因組DNA，用通用引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′和1492r：5′-CTACGGCTACCTTGTTAC GA-3′，對 基 因 組DNA進 行16S rRNA片 段 擴 增。PCR反應體系為：95 °C、5 min；94 °C 30 s，58 °C 30 s，72 °C 60 s，30個循環；72 °C 10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測3 μL PCR產物，委托生工生物工程（上海）股份有限公司檢測。將16S rRNA基因序列與GenBank數據庫中已知序列進行BLAST比對分析，下載同源性較高的序列。采用MEGA 5.0中Neighbor-Joint法構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 菌株15-6發酵液的抑菌譜的測定

從表1中可以看出，15-6 菌株發酵液除對油菜菌核病的抑制作用為 45.29%外，抑制率在50%以上是其他11種供試病原菌。其中抑制率最高的是芒果炭疽病菌，為80.34%，之后是大麥條紋病和芒果莖腐病，分別為73.14%和71.47%，可見菌株15-6的發酵液抗菌范圍較廣。

表1 菌株15-6發酵液的抑菌譜

2.2 菌株15-6發酵液的熱穩定性

指示菌是膠孢炭疽菌。從圖1中可以明顯看出，在受到顯著不同的溫度處理過后，菌株15-6的發酵液良好的熱穩定性和抗菌活性仍然表現顯著。在60℃以及80℃時利用不同時間處理后抗菌效果表現出無明顯的改變， 但是當溫度明顯高于80℃時，發酵液的抗菌活性明顯降低，發酵液經100℃高壓蒸汽滅菌后，抑菌率僅是43.39%，當121℃高壓蒸汽滅菌后，它的抑菌率僅是4.23%。

圖1 菌株15-6發酵液的熱穩定性

2.3 菌株15-6發酵液的酸堿穩定性

由圖 2 可見，菌株15-6發酵液的抗菌活性對酸堿度敏感。當pH值為3和5時，抑菌率分別為59.02%和30.37%，當pH值為7時，抑菌率最高。為80.34%。抑菌率在pH值為9時為60.26%，pH值為11時為42.49%，pH值為13時僅為11.32%。

圖2 菌株15-6發酵液的酸堿穩定性

2.4 菌株15-6發酵液的酶穩定性

從圖3可以得出，不同蛋白酶對菌株15-6發酵液的抗菌活性沒有顯著影響，說明發酵液的抗菌效果對3種被測蛋白酶顯示不敏感。

圖3 菌株15-6發酵液的蛋白酶穩定性

2.5 紫外照射下菌株15-6發酵液的穩定性

紫外輻射穩定性是開發生物農藥的重要指標之一，從圖4可以看出，菌株15-6發酵液在紫外輻射30 min內的抑制率低于對照。在經過40 min以后，由于紫外光照射時間的不斷加長，顯著降低了它的抑制活性，但60 min后抑制率僅是37.14%。

圖4 菌株15-6發酵液的紫外線照射穩定性

2.6 菌株15-6發酵液中重金屬離子的穩定性

從圖5可以看出，不同重金屬離子對菌株15-6發酵液的抑菌活性無顯著影響，表明該發酵液對所測4種金屬離子的抑菌效果不具有敏感性。

圖5 菌株15-6發酵液的重金屬離子穩定性

2.7 菌株15-6的鑒定

2.7.1 菌株15-6的形態特征及生理生化試驗 革蘭氏染色陽性。菌株在Gao’s No.1培養基上的單個菌落呈扁平、圓形或近圓形。正面白色，背面深褐色，無可溶性色素。菌絲生長發育良好，無裂口和隔膜；氣生菌絲生長良好，分枝多，孢子絲直而柔韌，孢子圓或卵圓形，表面光滑（圖6）。這些特征與鏈霉菌一致。2.7.2 生理生化試驗 由表2可知菌株15-6能利用葡萄糖、半乳糖、赤蘚糖和海藻糖分解含硫氨基酸，過氧化氫酶陽性，淀粉水解，明膠液化，產生吲哚乙酸和過氧化氫，但纖維素不能水解，硝酸鹽減少，脲酶反應為陰性，不使用解蔗糖、阿拉伯糖、棉子糖、鼠李糖和甘露醇。

圖6 菌株15-6的形態

表2 菌株15-6生理生化試驗結果

2.7.3 菌株15-6 16S rDNA序列測定及系統發育分析

對菌株15-6的16S rDNA擴增產物進行測序（生物工程（上海）有限公司）。與GenBank中的基因序列然后進行在線地比對，結果顯示，該序列與多個菌株的16S rDNA序列具有99.99%的同源性。以16S rDNA的系統發育分析說明為基準，菌株15-6與登錄號為NR112268.1和KF730779.1黃三素鏈霉菌Streptomyces flavotricini的親緣關系最近，屬于同一系統發育分支（圖7）。

圖7 基于16S rDNA的系統發育樹

3 結 論

黃三素鏈霉菌15-6發酵液對12種供試植物病原菌的菌絲生長都有較強的抑制效果，其中對芒果炭疽菌的抑制率最強為80.34%。指示菌為芒果膠孢炭疽菌，在溫度低于80℃時15-6 菌株發酵液熱穩定性較好；對酸堿性條件很敏感，pH值在6～8時抗菌作用較強；在紫外線照射下具有穩定性良好的特性，對重金屬離子和蛋白酶表現出不敏感的性質。綜上所述，該菌株的具體抗菌機制和活性物質還必須進一步進行探討研究。

4 討 論

目前植物病害的主要防治方法是殺菌劑等化學防治方法，但長期使用化學藥劑不僅容易威脅人類健康和生態環境，而且容易導致土壤污染、農藥殘留和環境污染。生物防治是一種符合安全、健康和環境保護要求的可持續發展手段。目前對于芒果膠孢炭疽菌的生物防治已有許多報道。

楊苑等[7]篩選的抗生素溶桿菌L-44對云南芒果采后炭疽病原菌的抑制率達53.70%；何秀娟[8]篩選的瓦爾維亞假絲酵母X-1對炭疽病的發病率控制在40%以下，與200 mg/L的多菌靈的防治效果無明顯差異；趙超等[9]從芒果葉片與果實分離篩選出2株對芒果采后炭疽病原菌具有較好抑制效果的熒光假單胞菌A1和枯草芽孢桿菌C13，兩者的10倍發酵稀釋液的防效分別為80.05%和71.73%?；诖税l現，生物防治芒果膠孢炭疽菌的相關生防菌多集中于酵母菌和細菌。該研究篩選出1株對芒果膠孢炭疽菌有較強抑制作用的鏈霉菌，而關于鏈霉菌對該菌的生物防治研究較少。鄭金土等[10]研究結果表明，黃三素鏈霉菌YZF3對楊梅潰瘍病菌有較強的抑制作用。薛磊等[11]報道，黃三素鏈霉菌能顯著抑制大麗輪枝菌（Verticillum dahliae）菌絲生長、微菌核形成及萌發，在防治由大麗輪枝菌引起的黃萎病中有使用潛力。Khalil等[12]從稻田獲得的黃三素霉菌，該菌的代謝產物綠黃菌素對水稻稻瘟病菌有明顯的抑制作用。Patil等[13]分離到的黃三素鏈霉vh8菌能保護番茄根部減少茄絲核菌（Rhizoctoni solani）侵染，防治效果達59.86%，還具有促進番茄的生長作用。黃三素鏈霉菌的抑菌機制在不同的方面有不同的表現，不同的菌株可能有不同的抗菌機制，但它們主要產生抗菌活性物質。抑菌活性物質主要有抗菌蛋白和抗生素等[14-15]。