硝酸鉈對斑馬魚胚胎的發育毒性

范力海，張欣彤，侯麗萍

（廣州大學生命科學學院，廣東 廣州 510655）

鉈（Tl）是一種劇毒元素，以一價和三價2種形式存在于環境中。鉈廣泛存在于水環境中，主要來源于含鉈礦石的加工冶煉及工業廢水的排放[1]。據報道，我國含鉈的鉛鋅礦床主要分布于廣東、甘肅、湖南、云南、陜西等地。有調查顯示，河南某家礦產冶煉企業廢水中鉈的濃度可達361 μg/L[2]。此外，受礦產冶煉影響的農田土壤也存在鉈污染的風險。Zhou等[3]對貴州多處受污染村落農田土壤中的鉈殘留量進行了調查，發現土壤中鉈含量最高可達4.97 mg/kg。而且土壤中的鉈可經降雨等途徑進入水環境或通過污染農作物直接對人造成危害。因此，環境中高濃度鉈的存在會對水生生物生存及人類生活生產造成極大的威脅。

最早，鉈鹽曾用于治療頭蘚等疾病，或者用來制作農藥及殺鼠劑，由于意外攝入導致了多起人體中毒事件。近10 a，我國發生了多起水環境鉈污染事件，例如2010年廣東北江河段鉈污染事件，2013年廣東賀江河段鉈污染事件，2017 年嘉陵江鉈污染事件等[4]。人體對鉈的吸收速度快、途徑廣，皮膚、呼吸道和胃腸道接觸均可引發中毒[5]。鉈進入生物體后，可通過干擾鉀依賴途徑、取代Na+/K+-ATP酶中的鉀離子、強烈的親硫性（與蛋白質或其他生物分子中的巰基具有高親和力）等多種途徑對生物體造成毒害。由此可知，鉈是目前已知的毒理作用較為復雜且毒性較為嚴重的劇毒金屬之一[6-7]。

斑馬魚（Danio rerio）是被人們廣泛接受并用于胚胎發育、遺傳分析、毒理學和多種人類疾病研究的理想模式生物。運用斑馬魚進行毒理試驗具備操作簡便、成本低、影響因素少并可以監測多種毒性指標等優點[8-9]。筆者以斑馬魚為研究對象，探討硝酸鉈對斑馬魚胚胎發育的不利影響，測定指標包括心率、形態發育、超氧化物歧化酶（SOD, superoxide dismutase）和過氧化氫酶（CAT, catalase）活性及幼魚行為，以期為評價水環境中鉈對生物體的毒性效應提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 AB品系斑馬魚購自上海費曦生物技術有限公司。AB品系成年斑馬魚于水循環養殖系統中雌雄分開養殖至長期穩定，光照周期h光照∶h黑暗=14∶10，每天喂食1～2次豐年蝦脫殼卵。胚胎的獲取：試驗前一晚提前將成年斑馬魚進行避光處理，次日上午（10點后）將成魚按雌∶雄=2∶1的比例裝入孵化盒中，產卵后1 h內收集魚卵，在解剖鏡下挑選正常受精、形狀飽滿的受精卵用于胚胎毒性試驗。

1.1.2 試劑與儀器 主要試劑有三水硝酸鉈[純度≥97.5%，阿法埃莎（中國）化學有限公司]，超氧化物歧化酶（SOD）ELISA檢測試劑盒、過氧化氫酶（CAT）ELISA檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）。試驗用水為曝氣自來水，所有暴露液均為每次試驗前新配置。主要儀器有體式顯微鏡及成像系統（Leica MC170 HD，新加坡），酶標分析儀（Rayto RT-6100，中國），高清攝像頭（RERVISION RERBXH2MP 0550，中國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 暴露方法 設置4個硝酸鉈暴露濃度，分別為5、50、500、1 000 μg/L，并設置空白對照組（經ICD-MS分析，鉈濃度低于0.01 μg/L）。每個濃度組處理32枚胚胎，并設置3個平行組。將正常發育的胚胎隨機分裝于24孔板（1枚胚胎/孔），每孔加入1.5 mL溶液，光照周期h光照∶h黑暗=14∶10，溫度27℃，暴露總時間為168 h，每24 h更換一次溶液，及時吸出死亡的胚胎或幼魚。

1.2.2 斑馬魚胚胎形態觀察及心率記錄 進行硝酸鉈暴露處理后，使用體視顯微鏡觀察斑馬魚胚胎在發育過程中的形態變化，并使用顯微鏡攝像系統獲取胚胎形態照片與心博視頻用于形態觀察與心率計數。

1.2.3 胚胎酶活性檢測 將胚胎置于離心管中，每處理選取8枚胚胎，去除殘余液體，稱量后加入一定量的PBS（pH值7.4），用勻漿器將標本勻漿充分。3 000 r/min離心20 min，收集上清，按試劑盒說明書方法測定SOD及CAT酶活性。

1.2.4 幼魚行為記錄 每次試驗開始時隨機挑選1條暴露168 h的斑馬魚幼魚放入透明塑料立方盒（2.9 cm×2.9 cm×1.9 cm，盛有16 mL的對應暴露試驗溶液）中。立方盒放置在RERVISION高清攝像頭鏡頭下，并調試設備與軟件設定（Noldus EthoVision XT 11.5）。用發光板進行白光照射，并阻擋日光。行為測試在同一時間段內進行，且所有試驗在3 h內完成。斑馬魚的行為由攝像裝置以每秒60幀（fps）、1 280×720像素分辨率進行監測記錄。每條斑馬魚放入盒中后，適應1 min后錄制5 min的行為活動。斑馬魚幼魚皆可在盒中自由游動，其游動軌跡被攝像機記錄并傳入計算機，由 Noldus EthoVision XT 11.5軟件記錄并分析。區域的劃分參考EthoVision XT 操作參考手冊（EthoVision XT Reference Manual）：在垂直組中，將立方盒側剖面正方體區域作為斑馬魚整體活動范圍，并在軟件中將該區域按三等分劃分為上層、過渡層、底層3個區域；在平面組中，將立方盒俯視面正方體作為斑馬魚整體活動范圍，并在軟件中按2∶1將該區域分為中心區與邊緣區。對照組、5 μg/L及50 μg/L TlNO3試驗組，各組隨機挑取斑馬魚幼魚10條，記錄每條斑馬魚5 min內的移動距離、平均速度與在各區域內的停留時間[10-11]。

1.2.5 統計學分析 使用IBM SPSS Statistics 26統計分析軟件分析試驗數據，并進行單因素方差分析（oneway ANOVA）、差異顯著性分析及t檢驗。試驗數據以平均值±標準差（Mean±SD）表示。

2 結果與分析

2.1 硝酸鉈對斑馬魚心率的影響

由于暴露168 h時1 000 μg/L TlNO3處理組幼魚數不足以進行統計分析，故選取暴露48、96與156 h時各處理組斑馬魚幼魚心率進行比較，結果如圖1所示。處理48 h后，各組斑馬魚胚胎心率相近，統計學上無顯著差異。處理96 h后，50、500及1 000 μg/L TlNO3處理組幼魚心率與對照組相比顯著降低。處理156 h后，50、500和1 000 μg/L TlNO3處理組幼魚心率與對照組相比顯著降低，且下降幅度隨著硝酸鉈濃度的增加而增大。此外，500、1 000 μg/L TlNO3處理組暴露156 h后斑馬魚幼魚的心率顯著低于暴露96 h時的。

圖1 不同暴露時間各處理組斑馬魚的胚胎心率

2.2 硝酸鉈對斑馬魚胚胎發育的致畸型毒性

斑馬魚胚胎于受精后72 h進入孵化期，在此之前各試驗組胚胎形態無明顯區別（圖2）；暴露84 h時500和1 000 μg/L TlNO3處理組幼魚出現孵化延遲或發育阻滯的現象，幼魚卵黃囊仍膨大，魚鰾發育慢于對照組；暴露144 h時50、500及1 000 μg/L TlNO3處理組幼魚出現魚鰾發育不完全、心囊水腫與脊柱彎曲的現象；暴露168 h時500及1 000 μg/L TlNO3處理組幼魚脊柱彎曲、心囊水腫現象變的更為明顯。

圖2 同暴露時間各處理組斑馬魚形態發育的比較

2.3 硝酸鉈對斑馬魚SOD酶活的影響

由圖3可知，與對照組對比，暴露24 h后，50、500、1 000 μg/L TlNO3處理組斑馬魚胚胎的SOD活性顯著降低；暴露72 h后，1 000 μg/L TlNO3處理組斑馬魚胚胎的SOD活性極顯著降低；暴露96 h后，5、50、500、1 000 μg/L TlNO3處理組斑馬魚胚胎的SOD活力分別降低6.7%、12.7%、33.7%、26.7%，其中500、1 000 μg/L TlNO3處理組與對照組差異極顯著。

圖3 不同暴露時間各處理組斑馬魚胚胎的SOD活性

2.4 硝酸鉈對斑馬魚CAT酶活的影響

由圖4可知，與對照組對比，暴露24 h后，50、500、1 000 μg/L TlNO3處理組斑馬魚胚胎的CAT活性顯著降低；暴露72 h后，50、500、1 000 μg/L TlNO3處理組斑馬魚胚胎的CAT活性極顯著降低；暴露96 h后，5、50、500、1 000 μg/L TlNO3處理組斑馬魚胚胎的CAT活力分別降低13.6%、34.4%、37.3%、57.0%，其中50、500、1 000 μg/L TlNO3處理組與對照組差異顯著。

圖4 不同暴露時間各處理組斑馬魚胚胎的CAT活性

2.5 硝酸鉈暴露對幼魚行為的影響

此次試驗用斑馬魚從受精后即開始進行各濃度TlNO3溶液暴露處理。暴露持續168 h后，500和1 000 μg/L TlNO3處理組斑馬魚幾乎全部死亡，對照組與5、50 μg/L TlNO3處理組剩余斑馬魚幼魚孵化后能夠自主活動。

由圖5A和D可知，對照組幼魚在進入新魚缸后，部分幼魚長時間在容器壁邊小幅度移動，大部分幼魚能夠在一段時間內自主開始探索四周，并在各區域保持較活躍的游動。

與對照組相比，5 μg/L TlNO3處理組幼魚進入新魚缸后比較活躍，表現為運動軌跡增多、運動軌跡紊亂（圖5B）、游動距離大（圖6）、平均速度快（圖7）等。該組幼魚在平面的游動總距離與平均速度遠大于對照組與50 μg/L試驗組的幼魚。在水平面上，停留在中心區域的時間占比更多（圖5B，圖8）；在垂直面上，該組幼魚更傾向在水底游動，且在游動時難以控制在水中漂浮的深度，具體表現在垂直面上反復下沉上浮（圖5E、圖9）。

圖5 各處理組斑馬魚幼魚平面及垂直運動的軌跡

圖6 0～50 μg/L TlNO3處理組斑馬魚幼魚平面游動的距離

圖7 0～50 μg/L TlNO3處理組斑馬魚幼魚平面游動的速度

圖8 0～50 μg/LTlNO3處理組斑馬魚幼魚在平面各區域停留的時間

與對照組相比，50 μg/L TlNO3處理組幼魚轉入新魚缸后出現長時間呆滯不動（圖5C）、游動時震顫和小范圍內多次擺動頭部等現象。在垂直面上，該組幼魚更傾向于長時間在水面呆滯（圖5F、圖9），且游動時難以下沉，這與形態觀察中暴露組幼魚的魚鰾發育不良的結果相吻合。

圖9 0～50 μg/LTlNO3處理組斑馬魚幼魚在垂直各區域停留的時間

以上結果表明，胚胎期和幼魚早期階段持續性硝酸鉈暴露能夠改變幼魚的行為方式。幼魚的行為強度變化與環境中鉈濃度之間存在倒“U”型的關系，即在168 h內，5 μg/L硝酸鉈暴露具有運動興奮效應，而50 μg/L硝酸鉈暴露則表現出抑制幼魚活動的作用。從胚胎時期開始長時間硝酸鉈暴露能夠影響斑馬魚胚胎的器官發育，從而損害幼魚的自發運動能力。

3 討 論

心率是衡量心臟活動與功能的重要指標之一。受精24 h后，斑馬魚心血管即將形成、心臟即將開始收縮[12]，受精48 h后即可在解剖鏡下清晰觀察到來自右側心室和左側心房的心臟環路，且隨著胚胎的不斷發育，斑馬魚成魚的心率能夠達到140～180次/min。因此，受精后48 h即可觀察斑馬魚胚胎的心跳頻率[13]。斑馬魚心臟易受毒物影響[14]，心跳的快慢在一定程度上也可以反映斑馬魚心臟在毒物脅迫下的發育情況與組織器官狀況，用于判斷硝酸鉈對斑馬魚生理發育的影響。

該試驗通過對斑馬魚心率的測定，發現暴露48 h時，各處理組斑馬魚胚胎心率差異不大；暴露96 h后，隨著斑馬魚幼魚的發育與孵出，各處理組的斑馬魚幼魚心率有所加快，但與對照相比，較高濃度的硝酸鉈處理使斑馬魚幼魚心率顯著下降；暴露156 h后，斑馬魚幼魚的心率與硝酸鉈處理濃度成反比，即硝酸鉈處理濃度越高，斑馬魚幼魚心率越慢，且500、1 000 μg/L TlNO3處理組暴露156 h后斑馬魚幼魚的心率顯著低于暴露96 h時的。

觀察發現，硝酸鉈對斑馬魚的致畸型毒性表現為幼魚發育阻滯、魚鰾發育遲緩或發育不完全、脊柱彎曲及心囊水腫等。斑馬魚胚胎發生心囊水腫的原因可能有2種，一是水屏障被破壞，一是體內的排水功能異常。魚類腎臟可以維持機體水和電解質的平衡，而腎臟功能的紊亂則可能導致血液高滲效應，使細胞外的液體排出血管，從而導致水腫的發生[15]。同時，鉈離子可以進入胚胎內部，通過損害Na+/K+-ATP酶、干擾蛋白質的合成、擾亂細胞膜內外的離子梯度，造成心囊水腫、脊柱彎曲等組織病變。Long等[16]研究發現，ABCC5在斑馬魚胚胎發育和解除重金屬毒性過程中發揮了重要作用。顯性失活的ABCC5會引起斑馬魚胚胎發育阻滯，而重金屬則可以導致斑馬魚胚胎ABCC5表達上調[17]。

試驗結果還表明，硝酸鉈處理顯著降低了斑馬魚胚胎的SOD和CAT酶活性，破壞了斑馬魚胚胎的抗氧化能力；同時還表現出劑量-效應關系[18]，即硝酸鉈濃度越高，SOD及CAT酶活性降低程度越大。SOD是活性氧清除劑，可以將生物經氧化產生的活性氧（ROS）自由基歧化為H2O2和O2，避免ROS對機體的毒害[19]。在低濃度或短時間內，胚胎內SOD活性因重金屬脅迫而升高，而在高濃度或長時間的重金屬脅迫下，胚胎內SOD活性則被抑制[20]。這些現象表明，硝酸鉈處理導致受試斑馬魚胚胎體內·O2-增多，超出了SOD的清除能力，抑制了SOD活性。CAT是過氧化物酶體的標志酶，可催化H2O2分解為O2和H2O，防止H2O2對機體的毒害[19]。該研究中硝酸鉈處理對CAT活性同樣表現為低濃度或短時間誘導-抑制、高濃度或長時間抑制。以上現象均表明，在硝酸鉈處理下，斑馬魚機體清除含氧自由基的機制已嚴重失衡，因此機體內過多的活性氧可能通過誘導ABCC5表達，從而導致胚胎發育阻滯。

斑馬魚是晝行性動物，在光照下活動，在黑暗中多表現為靜止狀態[21]。該試驗觀察了暴露處理168 h后的斑馬魚幼魚在新魚缸中的自發活動與行為。此時幼魚的肌節和心臟、腦、魚鰾等器官基本形成[22]。與病理損傷、生理生化數據相比，斑馬魚自發行為活動更能直觀地反映其整體功能發育。斑馬魚通常在靠近水面位置保持較活躍的游動，但在進入新魚缸后，通常會長時間待在容器底部、容器邊緣保持靜止不動，減少探索行為和停留在容器壁附近、水面附近的時間[10]，這表明斑馬魚處在一種高度焦慮的狀態下[23]。一段時間后，斑馬魚才會在新魚缸中開始四處探索[24]，增加魚缸中心區域停留、運動時間。

在較低濃度的硝酸鉈溶液暴露下，斑馬魚表現出較興奮狀態，游動距離長，游動平均速度快，推測低濃度的硝酸鉈暴露能影響斑馬魚胚胎的神經系統發育，改變其興奮抑制功能；而高濃度的硝酸鉈嚴重損害了斑馬魚的組織器官功能，從而使斑馬魚表現為長時間的呆滯與行動遲緩。斑馬魚幼魚的行為強度變化與環境中硝酸鉈濃度之間存在倒“U”型劑量效應關系，在5 μg/L硝酸鉈脅迫時斑馬魚幼魚活動增多、紊亂，游動距離與平均速度增大；50 μg/L硝酸鉈暴露使斑馬魚行為出現遲緩、呆滯、活動減少與長時間停留水面現象。故硝酸鉈暴露能夠影響斑馬魚幼魚的自發活動行為。較低濃度硝酸鉈暴露能使斑馬魚幼魚表現興奮狀態；較高濃度硝酸鉈暴露能使斑馬魚幼魚表現出遲緩呆滯狀態。且硝酸鉈處理組幼魚出現了難以控制在水中位置、下沉困難等現象，這與斑馬魚形態觀察結果中幼魚魚鰾發育不良的結果相吻合。