6種蕓香科藥材的特征圖譜及含量對比研究

王閩予，鄧淙友，陳康梅，羅文安，陳萬發，邱韻靜，胡綺萍

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東佛山 528244）

來源于蕓香科植物的藥材化橘紅、個青皮、四花青皮、陳皮、枳實、枳殼等為臨床常用中藥，其中化橘紅為蕓香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’或柚Citrus grandis（L.）Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮；個青皮為蕓香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實的果皮，5~6月收集自落的幼果，曬干，習稱“個青皮”，而7~8月采收未成熟的果實，在果皮上縱剖成四瓣至基部，除盡囊瓣，曬干，習稱“四花青皮”；陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮；枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實，7月果皮尚綠時采收，自中部橫切為兩半，曬干或低溫干燥；枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensisOsbeck的干燥幼果，5～6月收集自落的果實，除去雜質，自中部橫切為兩半，曬干或低溫干燥，較小者直接曬干或低溫干燥［1］。

蕓香科藥材中含有的黃酮類成分以橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷為代表，不同品種間主要成分相似性較高，特別是橘屬的青皮、個青皮、陳皮，以及橙屬的枳殼、枳實，上述品種為同一植物的不同成熟期，其近似性更高，但不同藥材的功效各有側重，因此對這些品種進行對比研究，為其市場監管以及臨床用藥安全提供參考方法具有重要意義［2］。目前，對于該類藥材的研究多見單味藥材指紋圖譜的研究［3-8］，以柚皮苷及橙皮苷作為含量測定的主要成分；未見有同一條件下對同屬藥材進行對比的研究報道。因此，本文通過UPLC技術對上述藥材進行特征圖譜和多指標含量測定研究，并結合相似度、聚類分析、主成分分析（principal component analysis,PCA）及偏最小二乘法-判別分析（partial least squares discrimination analysis,PLS-DA），比較常用蕓香科藥材的差異性，為蕓香科藥材的鑒別與質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters H-class型超高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Agilent SB C18（100 mm×2.1 mm,1.8 μm）；ME204E型萬分之一分析天平和P26百萬分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ500D數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q Direct型超純水系統（美國默克公司）。

1.2 試藥

柚皮苷（批號：110722-201714，質量分數：93.4%）、新橙皮苷（批號：111857-201804，質量分數：99.4%）、橙皮苷（批號：110721-201818，質量分數：96.20%）對照品由中國食品藥品檢定研究院提供；蕓香柚皮苷（批號：wkq19041908，質量分數：98.0%）、水合橙皮內酯（批號：wkq20031904，質量分數：98.0%）、川陳皮素（批號：wkq20031701，質量分數：98.0%）、橘紅素（批號：wkq16011401，質量分數：98.6%）對照品由四川維克奇生物科技有限公司提供；馬爾敏對照品（批號：CFS201901，質量分數：98.0%）由Chem Face生物有限公司提供；甲醇為分析純；磷酸、乙腈為色譜純；水為超純水。

藥材經廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定，H1~H11號樣品為蕓香科植物化州柚C.grandis的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，G1~G8號樣品為蕓香科植物橘C.reticulata及其栽培變種的干燥幼果，SH1~SH12號樣品為蕓香科植物橘C.reticulata及其栽培變種的干燥未成熟果實的果皮，C1~C7號樣品為蕓香科植物橘C.reticulata及其栽培變種的干燥成熟果皮，Z1~Z20號樣品為蕓香科植物酸橙C.aurantium及其栽培變種的干燥未成熟果實，ZS1~ZS12號樣品蕓香科植物酸橙C.aurantium及其栽培變種的干燥幼果。藥材具體信息見表1。

表1 藥材具體信息表Table 1 Specific information of Rutaceae Herbs

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent SB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相以乙腈為流動相A，以0.05%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0~7 min，15%→25%A；7~8 min，25%→40%A；8~10 min，40%→45%A；10~13 min，45%→60%A；13~15 min，60%→15%A）；流速為0.4 mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為320 nm；進樣量為1 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度分別為16.930、90.094、11.080、31.729、3.459、1.127、2.197、2.564 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過三號篩）約0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 特征圖譜方法學研究

2.4.1 精密度試驗 取同一批化橘紅（批號：H3）和枳殼（批號：Z3），分別按“2.3”項方法制備供試品溶液和“2.1”項色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖。分別以柚皮苷及橙皮苷為參照峰，計算各自共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結果各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 取同一批化橘紅（批號：H3）和枳殼（批號：Z3）供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.1”項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。分別以柚皮苷及橙皮苷為參照峰，計算共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結果各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗 分別取同一批化橘紅（批號：H3）和枳殼（批號：Z3）樣品粉末6份，按“2.3”項方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。分別以柚皮苷及橙皮苷為參照峰，計算共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結果各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，表明方法重復性良好。

2.5 特征圖譜分析及評價

2.5.1 特征圖譜的建立及共有峰歸屬 取70批樣品，分別按“2.3”項方法制備供試品溶液，按照“2.1”項色譜條件分析，將所得色譜數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（國家藥典委員會，2012.0版）進行結果分析，化橘紅確定7個共有峰（見圖1），個青皮確定9個共有峰（見圖2），四花青皮共確定9個共有峰（見圖3），陳皮確定7個共有峰（見圖4），枳殼確定11個共有峰（見圖5），枳實確定11個共有峰（見圖6）。其中3號峰（橙皮苷）分離度較好，響應較高，為藥材中抗炎、抗氧化、抗菌、保護心血管系統的主要成分之一［9］，故以3號峰（橙皮苷）為參照峰（即為S峰）；化橘紅藥材則以2號峰（柚皮苷）為參照峰。經與對照品色譜峰保留時間比對，并結合DAD光譜分析，共指認8個特征峰，峰1為蕓香柚皮苷，峰2為柚皮苷，峰3為橙皮苷、峰4為新橙皮苷、峰5為水合橙皮內酯、峰9為馬爾敏、峰10為川陳皮素、峰11為橘紅素（見圖7）。

圖1 11批化橘紅藥材UPLC特征圖譜共有峰Figure 1 UPLC characteristic spectrum common peaks of 11 batches of Exocarpium Citri Rubrum

圖2 8批個青皮藥材UPLC特征圖譜共有峰Figure 2 UPLC characteristic spectrum common peaks of 8 batches of Fructus Citri Immaturi

圖3 12批四花青皮藥材UPLC特征圖譜共有峰Figure 3 UPLC characteristic spectrum common peaks of 12 batches of Pericarpium Citri Reticulatae Viride

圖4 7批陳皮藥材UPLC特征圖譜共有峰Figure 4 UPLC characteristic spectrum common peaks of 7 batches of Pericarpium Citri Reticulatae

圖5 20批枳殼藥材UPLC特征圖譜共有峰Figure 5 UPLC characteristic spectrum common peaks of 20 batches of Fructus Aurantii

圖6 12批枳實藥材UPLC特征圖譜共有峰Figure 6 UPLC characteristic spectrum common peaks of 12 batches of Fructus Aurantii Immaturus

圖7 6種蕓香科藥材樣品共有峰對照品歸屬圖Figure 7 The chromatograms of common peaks of the refer‐ence substance in six kinds of Rutaceae Herbs samples

2.5.2 相似度評價結果 采用國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.0版本）”分別對70批蕓香科藥材樣品UPLC特征圖譜數據處理分析，采用平均數，時間窗口為0.1，自動匹配，分別以枳實、枳殼、個青皮、四花青皮、陳皮、化橘紅共有模式作為對照特征圖譜，計算相似度系數，結果表明蕓香科同一藥材不同批次間的化學成分具有較好的一致性，結果見表2。

表2 6種不同品種藥材樣品相似度評價結果Table 2 Similarity evaluation results of six kinds of Rutaceae Herbs

2.5.3 不同品種藥材UPLC特征圖譜相似度比較分別將上述6種蕓香科藥材的對照圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.0版本）”軟件，結果顯示，不同基原樣品間指紋圖譜共有峰信息和相似度均有差異，表明即使是同屬的藥材，化學成分亦存在著差異，見表3。

表3 6種不同品種藥材對照特征圖譜相似度評價結果Table 3 Similarity evaluation results of control characteristic chromatograms of six kinds of Rutaceae Herbs

2.5.4 聚類分析 運用SPSS 20.0軟件對70批藥材樣品中16個共有峰的峰面積為數據進行系統聚類，采用Ward聯結法，以Euclidean距離作為樣品相似度的距離公式，分析結果見圖8，當判斷距離為5時，結果顯示70批藥材被分為4類：Ⅰ類包括H1~H11，即化橘紅（柚的果實）為一類，Ⅱ類包括Z1~Z20，即枳殼（酸橙未成熟果實），Ⅲ類包括ZS1~ZS12，即枳實（酸橙干燥幼果），Ⅳ類包括G1~G8、SH1~SH12、CP1~CP7，即橘不同成熟期的果實（個青皮、四花青皮、陳皮）為一類。

圖8 聚類分析結果Figure 8 Results of cluster analysis

2.5.5 主成分分析 以70批藥材樣品中的20個共有峰的峰面積數據，通過Graph Prism9軟件對其進行主成分分析，得出相關矩陣的特征值和方差，見表4。結果顯示，前4個主成分的累計方差貢獻率達84.045%，故選擇前4個主成分可代表化橘紅、個青皮、四花青皮、陳皮、枳殼和枳實6種藥材特征圖譜共有峰的大部分信息。由初始因子載荷矩陣（表5）可知，第1主成分主要反映色譜峰10（川陳皮素）、峰11（橘紅素）、峰18、峰19和峰20的信息，第2主成分主要反映色譜峰12、峰13的信息。通過計算各樣品主成分得分（表6），不同品種之間主成分得分差異較明顯，如化橘紅的主成分2得分最高；個青皮、四花青皮、陳皮的主成分1得分較高；枳殼的主成分4得分最高；枳實的主成分得分則整體偏低；雖然主成分3及主成分4反映的色譜峰信息權重值占比較低，在二維圖上不呈現，但柚、橘、酸橙3大類藥材在主成分得分上仍存在明顯差異。

表4 主成分特征值及貢獻率Table 4 Principal component eigenvalue and contribution rate

表5 主要因子載荷矩陣Table 5 Main factor load matrix

表6 主成分得分Table 6 Principal component score

2.5.6 偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）主成分分析結果顯示，不同成熟期的樣品相似性較高，較難區分，本研究采用PLS-DA對不同成熟期的橘（個青皮、四花青皮、陳皮）以及酸橙（枳殼和枳實）進行分析。

所建立的橘（個青皮、四花青皮、陳皮）的模型，R2X（cum）=0.854，R2Y（cum）=0.929，Q2（cum）=0.894，均大于0.5，說明該模型穩定可靠，該模型可將不同成熟期橘的果實個青皮、四花青皮、陳皮樣品分為3類；從10個變量的VIP值圖，以VIP>1.0為顯著影響，共找到4個差異標志物，其影響顯著性排序為峰1（蕓香柚皮苷）>峰3（橙皮苷）>峰4（新橙皮苷）>峰17，提示該幾個化學成分對于區分不同成熟期橘的果實（個青皮、四花青皮、陳皮）貢獻率較大，結果見圖9。

圖9 個青皮、四花青皮和陳皮的PLS-DA分析圖Figure 9 PLS-DA analysis chart of Fructus Citri Immaturi，Pericarpium Citri Reticulatae Viride and Pericarpium Citri Reticulatae

所建立的酸橙（枳殼和枳實）的模型，R2X（cum）=0.751，R2Y（cum）=0.919，Q2（cum）=0.867，均大于0.5，說明該模型穩定可靠，該模型可將不同成熟期橘的果實枳殼、枳實樣品分為2類；從11個變量的VIP值圖可知，以VIP>1.0為顯著影響，共找到5個差異標志物，其影響顯著性排序為峰4（新橙皮苷）>峰2（柚皮苷）>峰9（馬爾敏）>峰10（川陳皮素）>峰3（橙皮苷），提示這幾個化學成分對于區分不同成熟期酸橙的果實（枳殼和枳實）貢獻率較大，結果見圖10。

圖10 枳殼和枳實的PLS-DA分析圖Figure 10 PLS-DA analysis chart of Fructus Aurantii and Fructus Aurantii Immaturus

2.6 多指標質量分數的測定

據文獻報道，蕓香科植物藥材藥效成分主要為黃酮類化合物，普遍具有理氣健脾、化痰等相似功效［10-12］。因此，在進行特征圖譜研究的同時選擇黃酮類成分（蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷）和脂溶性成分（水合橙皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素）作為質量控制指標，為該類藥材的質量評價提供參考。

2.6.1 色譜條件 同“2.1”項。

2.6.2 供試品溶液的制備 同“2.3”項。

2.6.3 精密度試驗 取枳殼供試品溶液（批號：Z3），按“2.6.1”項色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，結果測得蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮、水合橙皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素峰面積的RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 線性范圍、檢測限及定量限 精密稱定蕓香柚皮苷對照品3.403 mg、柚皮苷對照品5.512 mg、橙皮苷對照品2.306 mg、新橙皮苷對照品5.320 mg、水合橙皮內酯對照品0.706 mg、馬爾敏對照品2.299 mg、川陳皮素對照品2.242 mg、橘紅素對照品2.600 mg，加甲醇制成質量濃度分別為336.632 5、514.820 8、221.606 6、528.808 0、69.188 0、225.302 0、219.716 0、256.438 0 μg/mL的混合對照品溶液。分別加甲醇稀釋制得7個不同質量濃度的對照品溶液，以質量濃度（μg/mL）為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），進行線性回歸，得到各個對照品回歸方程及線性范圍。分別以信噪比S/N=3和信噪比S/N=10的對照品濃度為檢測限和定量限。結果見表7。

表7 回歸方程及線性范圍、檢測限及定量限Table 7 Regression equations，linear range，LOD and LOQ

2.6.5 穩定性試驗 取枳殼供試品溶液（批號：Z3），按“2.6.1”項色譜條件分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，記錄峰面積，結果測得蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮、水合橙皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素峰面積的RSD均小于2%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.6.6 重復性試驗 取枳殼樣品6份（批號：Z3），按“2.6.2”項方法制備供試品溶液，按“2.2”項色譜條件進行測定，結果測得蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮、水合橙皮內酯、馬爾敏、川陳皮素、橘紅素質量分數的RSD均小于2%，表明測定方法重復性良好。

2.6.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的枳殼飲片（Z3）0.075 g，平行6份，加入與樣品中含量等量的對照品，按“2.6.2”項方法制備供試品溶液，按“2.2”項色譜條件進行測定，計算加樣回收率。結果見表8。

表8 （續）

表8 加樣回收率試驗結果Table 8 The results of recovery

2.6.8 質量分數測定結果 精密稱取70批樣品，按“2.6.2”項方法制備供試品溶液，按“2.6.1”項色譜條件進樣測定，結果見圖11?？梢?，蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素、橘紅素5個成分可在橘（個青皮）及酸橙（枳殼和枳實）檢出；橘（陳皮）可檢出橙皮苷、川陳皮素、橘紅素成分；橘（四花青皮）可檢出蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘紅素成分。

圖11 6種蕓香科藥材各指標成分的質量分數占比圖Figure 11 The proportion of each index content in 6 kinds of Rutaceae Herbs

3 討論

本研究通過建立不同蕓香科藥材的特征圖譜結合化學計量法對不同蕓香科藥材進行分析，結果顯示同基原間的樣品相似性較高，不同基原間的樣品則差異性較大。通過聚類分析、主成分分析顯示，不同成熟期樣品存在部分批次交叉交集的情況，原因可能為不同采收期的樣品僅在化學成分的量上有差異；進一步采用PLS-DA單獨分析，可將同一基原中不同成熟期果實進行區分。結合上述分析結果，說明不同蕓香科藥材不同基原樣品雖然主要成分近似，但由于包含的化學成分種類不一，可清晰的進行區分；而同基原的不同成熟期樣品，其成分種類相似，差異多體現含量上，可結合化學計量法進行鑒別。

本文結果顯示，蕓香科植物藥材不同基原8個化學成分比例具有差異性，柚（化橘紅）中柚皮苷含量占比最高；橘（個青皮、四花青皮、陳皮）中橙皮苷含量占比最高，且橙皮苷含量均值從高到低為：個青皮>四花青皮>陳皮；酸橙（枳殼和枳實）均含有8個化學成分，柚皮苷及新橙皮苷含量占比較高，且枳實整體含量均高于枳殼?；谏鲜鼋Y果，推測不同蕓香科藥材中化學成分含量及種類具有一定的差異；且同一基原的藥材，隨著成熟度的增加，部分黃酮類成分含量整體呈下降趨勢。本文研究結果與文獻[10-12]報道的“臨床藥效表明陳皮的理氣作用弱于青皮，枳殼的理氣作用弱于枳實，原因可能與黃酮類成分的含量下降有關”相似。

本研究建立的UPLC特征圖譜方法較全面地反映了蕓香科藥材的化學成分，并同法測定了已歸屬的8個特征性成分，分析方法迅速簡便，利用聚類分析、主成分分析和偏最小二乘判別分析可以有效區分上述蕓香科6種藥材，且該6種藥材含有的黃酮類成分組成及含量存在顯著差異，為蕓香科藥材資源的進一步研究及質量控制提供了依據。