人胃癌細胞Caveolin-1基因的表達與DNA甲基化修飾之間的關系研究

毛立祺 戴春艷 金威洋 傅宇斐 陳喆 呂賓 王曦

1.浙江中醫藥大學附屬第一醫院浙江省消化道疾病病理生理研究重點實驗室 杭州 310006 2.湖州市第一人民醫院 3.杭州師范大學生命與環境科學學院

胃癌是嚴重危害人類健康和生命的最常見惡性腫瘤之一，在世界所有癌癥死亡率中排名第二[1]。胃癌發生早期，多數患者無明顯癥狀，而多數患者診斷出胃時都已經發展為進展期胃癌。統計發現，超過50%的胃癌患者會選擇外科手術治療，但是術后約60%～70%會發生轉移。一般而言，胃癌患者平均5年生存率約22%，其中晚期胃癌患者5年生存率小于5%[2-3]。

小窩蛋白-1或窖蛋白-1（Caveolin-1，Cav-1）分子量22kDa，是胞膜窖（caveolae）的標志性蛋白，是近年發現的一個候選抑癌基因，在很多生理和病理過程中扮演著重要的角色，不僅參與細胞內吞、膽固醇運輸、信號轉導、血管生成等過程，與腫瘤的發生、發展、浸潤、轉移等生物學行為也密切相關[4]。國內外研究發現，Cav-1在胃上皮細胞中的表達水平隨著胃癌的發生和發展而呈進行性下調乃至缺失[5-7]；而胃癌晚期，Cav-1的表達再次升高，且與胃癌晚期患者的不良預后密切相關[8]。研究表明，腫瘤晚期Cav-1的再次高表達能夠提高腫瘤細胞侵襲、轉移能力及對抗腫瘤藥物的耐受能力，并抑制細胞凋亡，維持細胞存活[9-10]。由此可見，Cav-1在腫瘤發生、早期轉化以及惡性發展中的作用存在異質性，但其具體的調控機制尚不清楚。研究發現，Cav-1基因的表達受到轉錄前水平和轉錄水平的調控，且該基因的表達變化與甲基化修飾導致的轉錄活性改變有關[11]。越來越多證據指出，基因的表觀遺傳學調控是引起基因轉錄活性改變，導致基因功能異常或喪失的主要形式[12-15]。因此，本研究擬探討甲基化修飾對胃癌Cav-1基因表達的影響，以期為胃癌的臨床治療尋找新的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人正常胃黏膜上皮細胞（gastric epithelial cells，GES1）、人胃癌細胞系MGC-803和AGS均購于中國科學院細胞庫/干細胞庫。

1.1.2 主要試劑 洛斯韋爾·帕克紀念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）1640培養基和F12培養基均購于美國Hyclone公司（批號：22400105、11765062）；胎牛血清購于蘭州民海生物有限公司（批號：SA112.02）；含0.02%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶購于杭州吉諾生物有限技術公司（批號：GNM25200）；逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑均購于大連寶生物技術有限公司（批號：RR036A、RR091A）；總DNA/RNA提取試劑盒購于美國Omega Bio-tek公司（批號：R6731-001）；甲基化熒光定量PCR試劑盒購于美國Zymo生物有限公司（批號：D5310）。

1.1.3 主要儀器和設備 DK-8D型電熱恒溫水槽購于上海精宏實驗設備有限公司；Sorvall ST 16R型高速冷凍離心機、ABI 7900型實時熒光PCR儀和3131型二氧化碳培養箱均為賽默飛世爾科技公司產品；ND-1000型分光光度計購于基因有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 GES1、MGC-803和AGS細胞均采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，置于37℃、5% CO2的水套式細胞培養箱中培養。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）檢測Cav-1基因的mRNA水平 使用總DNA/RNA提取試劑盒，同時提取各細胞系的基因組DNA和總RNA。總RNA定量后，反轉錄為cDNA，采用β-actin作為內參（NM_001101.3），以Real-time qPCR分別檢測各細胞系的Cav-1、Cav-1α和Cav-1β的mRNA表達水平，其中Cav-1的引物檢測區域包含了Cav-1α和Cav-1β兩種亞型的蛋白質編碼 （coding sequence，CDS）區；Cav-1α的引物檢測區域僅包含Cav-1α的CDS區（NM_001753.4）；Cav-1β的引物檢測區域僅包含Cav-1β的CDS區（NM_001172895.1），引物序列見表1。以反應達到閾值所需的循環數（cycle threshold，CT）值，來計算每種基因mRNA的相對表達量。

表1 Real-time qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences of Real-time qPCR

1.2.3 甲基化熒光定量PCR檢測Cav-1α甲基化水平分別取MGC-803和AGS細胞基因組DNA 20ng，與一步法甲基化熒光定量PCR試劑盒內的檢測緩沖液和參照緩沖液混合后，轉入384孔板內，以人全甲基化和未甲基化DNA為對照，對Cav-1α啟動子區甲基化水平進行檢測，檢測緩沖液組反應達到閾值所需的循環數為CT檢測值，參照緩沖液組的循環數為CT參照值，以兩者之差來計算不同胃癌細胞株該區域的甲基化水平，甲基化水平=100×2CT檢測值-CT參照值，引物序列見表2。

表2 甲基化Real-time qPCR引物序列Tab.2 Primer sequences of Real-time qPCR for methylation detection

1.3 統計學分析 應用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析。正態分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 人Cav-1基因的表達與其亞型的關系 Real-time qPCR結果發現，MGC-803細胞系的Cav-1表達為GES1細胞的（1.782±0.489）倍，差異具有統計學意義 （P＜0.05），而AGS1中Cav-1的表達是GES1的（0.017±0.002）倍，差異具有統計學意義（P＜0.001）。見圖1A。由此，本研究篩選到了Cav-1高表達和Cav-1低表達的胃癌細胞系，進一步分別檢測了三個細胞系Cav-1α和Cav-1β的mRNA表達水平，結果發現MGC-803細胞中Cav-1α的mRNA表達水平是GES1細胞的（2.604±0.945）倍，差異具有統計學意義（P＜0.01）；而AGS細胞中Cav-1α的mRNA表達是GES1細胞的（0.0005±0.00003）倍，差異同樣具有統計學意義（P＜0.001）。見圖1B。MGC-803和AGS細胞比較，Cav-1β的mRNA表達差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖1C。以上結果提示，對于人胃癌細胞系Cav-1基因mRNA的表達水平的改變主要與其α亞型的表達改變有關。

圖1 GES1、MGC-803和AGS細胞中Cav-1基因及其兩種亞型的mRNA表達情況比較Fig.1 Comparison of the expression of Cav-1 and its two isoform mRNA in GES1，MGC-803 and AGS cell

2.2 人Cav-1基因磷酸胞苷酰（基）鳥苷（cytidylyl phosphate guanosine，CpG）島的預測 利用在線軟件MethPrimer -Design Primers for Mehtylation PCRs（http://www.urogene.org/methprimer/indexl.html），針對Cav-1α的啟動子區和第一外顯子區的CpG島區域進行預測和分析。結果發現，僅Cav-1α的啟動子區存在CG位點富集的CpG島區域，大小為174bp，包含了17個CG位點。根據甲基化限制酶的酶切位點，將該段CpG島分為兩個片段進行分析和檢測，以轉錄起始位點（transcription start site，TSS）為+1，第1個片段在TSS的上游-250～-159的區域內，包含7個CG位點；第2個片段在TSS上游的-158～-77的區域內，包含10個CG位點。見圖2。

圖2 人Cav-1α基因CpG島預測Fig.2 Analysis in the CpG island of human Cav-1α gene

2.3 不同胃癌細胞系人Cav-1基因CpG島內的甲基化水平比較 針對上述CpG島內的兩個區域，經過甲基化qPCR檢測發現，對于MGC-803（Cav-1+/+）細胞系而言，第1個區域的甲基化水平為（41.4±11.0）%，第2個區域的甲基化水平為（5.6±0.6）%；對于AGS（Cav-1-/-）細胞系而言，第1個區域的甲基化水平為（12.9±6.6）%，第2個區域的甲基化水平為（75.2±27.6）%。 見圖3。 由此可見，MGC-803（Cav-1+/+）細胞系Cav-1α的高表達與其啟動子區第2個區域的低甲基化水平相一致，同樣AGS（Cav-1-/-）細胞系Cav-1α的低表達與其啟動子區第2個區域的高甲基化水平相符合。由此推測，胃癌細胞系中Cav-1α的mRNA表達水平可能與其基因啟動子區第2個區域內的10個CG位點的甲基化修飾程度密切相關。

圖3 MGC-803和AGS細胞Cav-1α基因啟動子區的甲基化水平比較Fig.3 Comparison of methylation level of Cav-1α at the promoter region in MGC-803 and AGS cell

3 討論

胞膜窖（Caveolae）是存在于分化的上皮和間充質細胞胞膜上的燒瓶狀胞膜內陷結構[16]，該結構的存在有利于多種受體和信號分子如蛋白激酶、G蛋白和黏附分子在胞膜上的富集，并為多種信號分子之間的相互作用提供場所[17]。Cav-1即窖蛋白-1，具有α和β兩種亞型，是胞膜窖重要的標志性結構蛋白，其作為腫瘤抑制因子，調節細胞的信號轉導、細胞增殖、分化、侵襲、黏附、細胞凋亡和代謝等多個過程[18]，參與腫瘤的發生和轉移[17]。

以往研究認為，Cav-1表達下調可以導致促細胞增殖的絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路和促細胞存活的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號通路的過度活化[19]，參與肺癌、卵巢癌、結腸癌和骨肉瘤等多種腫瘤的早期轉化和發展[20-23]。然而，近年來研究表明Cav-1具有抗凋亡、促進腫瘤侵襲和遷移和提高腫瘤耐藥的潛力[24-27]。在卵巢癌順鉑耐藥細胞株[28]、結直腸癌5-氟尿嘧啶耐藥細胞株[29]、肺腺癌多藥耐藥細胞株[30]中，均檢測到Cav-1的高表達，提示化療耐藥與Cav-1表達上調密切相關。由此可見，Cav-1在腫瘤發生發展的多個階段存在差異性表達的特點，而其表達水平的高低與不同時期腫瘤細胞生物學行為差異密切相關。因此，闡明影響Cav-1基因表達的調控機制，有利于在腫瘤進展的不同階段獲得針對性干預靶點。研究發現，我國傳統中藥能夠通過對靶點蛋白的表觀遺傳學調控，實現對胃癌的治療作用[31]。由此可見，深入闡明Cav-1基因的甲基化修飾機制也可為中藥抗腫瘤治療提供更多實驗依據。

本研究分別選擇Cav-1高表達和低表達的胃癌細胞株MGC-803和AGS，試圖尋找影響胃癌細胞中Cav-1基因表達變化的原因，并進一步探索不同胃癌細胞中Cav-1基因的兩種亞型Cav-1α和Cav-1β的表達差異。結果發現，Cav-1基因的mRNA表達與其α亞型的mRNA水平相一致，而與β亞型的表達無明顯關系。以往研究證實，DNA的甲基化往往抑制基因的活化，而DNA的去甲基化則能夠誘導基因的重新活化和表達。本研究發現，在MGC-803細胞中Cav-1α TSS的上游-158～-77區域內的CG位點的甲基化修飾水平非常低，僅為5.6%；而其mRNA表達水平是正常胃上皮細胞的2.6倍；而AGS細胞的mRNA表達水平僅為正常胃上皮細胞的0.0005倍，相同啟動子區的甲基化水平高達75.2%。可見，DNA甲基化的修飾程度直接關系到其mRNA表達水平的高低，并且與Cav-1α基因的轉錄活性呈負相關。本研究提示該區域內10個CG位點的甲基化修飾程度與Cav-1α基因的轉錄調控密切相關，而具體哪個位點或哪些位點的表觀修飾水平影響了Cav-1基因的表達，參與了胃癌哪一特定的發生發展階段，非常值得進一步深入研究。

綜上所述，胃癌細胞Cav-1基因的表達高低主要取決于其編碼的α亞型，并且其啟動子區-158～-77的甲基化程度決定了Cav-1α基因的轉錄激活水平。該結果提示基因的甲基化修飾機制可能是影響Cav-1基因表達的關鍵調控途徑，Cav-1α亞型的甲基化修飾的改變可能是造成其在胃癌發生不同階段表達水平不同的主要原因，這一證據可以為胃癌早期診斷以及胃癌晚期化療方案的制定提供一定的科學依據。