共聚焦顯微鏡在感染性角膜炎中的應用研究進展*

藍倩倩 綜述，曾思明 審校

(廣西壯族自治區人民醫院眼科，廣西 南寧 530021)

在發展中國家，感染性角膜炎的發生率僅次于白內障的致盲性眼病[1-2]，其病原學的鑒別一直是診斷的難點。傳統的檢查方法具有局限性，共聚焦顯微鏡能夠從細胞水平上對活體組織進行無創傷檢查，其在感染性角膜炎的診斷鑒別和治療指導上起到了功不可沒的作用。眼科工作者需要熟悉并掌握共聚焦顯微鏡在不同病原體感染性角膜炎中觀察到的特征，才能更好地應用其指導臨床工作。本文對共聚焦顯微鏡在感染性角膜炎中的應用進行了綜述，以期為臨床醫生提供參考。

1 感染性角膜炎現狀

感染性角膜炎是由多種因素引起角膜上皮細胞損傷之后病原體入侵從而導致炎性反應的病理過程。細菌、真菌、病毒是最常引起角膜感染的病原微生物，棘阿米巴引起感染性角膜炎的報道逐年增加，衣原體、結核桿菌等也可引起感染性角膜炎。角膜創傷、佩戴角膜接觸鏡被認為是感染性角膜炎的常見誘發因素。隨著我國步入老齡化社會，感染性角膜炎的發生率逐年增加，這與臨床上不合理使用免疫制劑、糖皮質激素及廣譜抗生素等因素密切相關。感染性角膜炎患者病情易反復發作、疾病遷延不愈，常與其他疾病混淆，因此誤診率高且治療困難大，如不及時治療可造成角膜穿孔、眼內炎、視力喪失等嚴重后果。感染性角膜炎的年發生率為0.36/10 000～79.90/10 000。由于多種因素的影響,不同地區甚至不同國家的感染性角膜炎流行病學的地區分布特點和發病相關危險因素存在差異。據統計，每年因角膜感染引起單眼盲的患者約有200萬例[3]。2002年于中國香港開展的感染性角膜炎研究顯示，感染性角膜炎發生率約為6.3/100 000，而在使用角膜接觸鏡的人群中，該病發生率高達3.4/10 000[4]。目前，中國內地尚未開展相關的流行病學研究。因此，應進一步研究，從而助力感染性角膜炎的臨床診療。

2 感染性角膜炎傳統檢查手段

引起感染性角膜炎的病原體種類繁多，且該病臨床表現復雜，易與其他疾病混淆，從而造成診治困難。為挽救感染性角膜炎患者的視力，避免造成角膜穿孔、眼內炎等嚴重后果，臨床醫生應快速明確診斷。目前，診斷感染性角膜炎不僅要根據患者病史及臨床特征進行鑒別，還需完善病原學的實驗室檢查。角膜刮片細胞學檢查、培養法和組織活檢法是常見的實驗室檢查方法，其中，角膜病灶刮片鏡檢能有效、快速粗篩病原菌。目前，診斷感染性角膜炎的“金標準”是病灶的病原學培養，但該輔助檢查存在較多缺陷，如：(1)標本范圍、部位會對病原學檢查結果造成一定影響。若取標本部位偏、范圍小，則病原體檢出陽性率偏低。擴大取標本范圍或進行多次取材，不僅病原體檢出陽性率偏高，且會人為地損傷患者角膜，加重疾病進展。(2)不同病原體生長周期長短各異，部分病原體培養周期久，等完成培養再治療會延誤診治。大多數真菌性角膜炎患者病原學培養周期為3 d，部分真菌的培養周期為5～7 d，培養周期需2周以上時間的真菌約占25%。(3)病原學檢出率低，不利于快速明確診斷與正確治療。1989-1998年開展的一項感染性角膜炎研究納入了2 220名細菌性角膜炎患者，結果顯示，患者角膜細菌培養標本陽性檢出率為22.1%[5]。山東省眼科研究所的一項研究收錄了1997-2005年的1 102例疑診細菌性角膜炎患者，完善角膜病灶的病原學培養后發現，陽性檢出率僅為18.2%[6]。

感染性角膜炎患者經過一段時間治療后，其角膜上皮已經愈合，此時評估病灶中是否殘留病原體及活動性炎癥，以此來選擇維持治療或減少用藥量甚至停藥至關重要。停藥過早會因治療不徹底引起病灶復發，延長治療時間不僅會增加藥物不良反應發生率，也增加了患者經濟負擔。因此，醫生必須對患者病情作出準確的判斷，若僅根據臨床表現判斷病情，要求醫生有豐富的經驗。而且，病原量減少之后刮片或培養的陽性率會更低，此時行角膜刮片病原學檢查，會導致已愈合角膜上皮受到人為破壞，延遲愈合時間，不利于患者視力恢復。

3 共聚焦顯微鏡的特點和優勢

共聚焦顯微鏡于1986年被學者CAVANAGH應用于觀察動物角膜，開展動物實驗[7]。1989年，共聚焦顯微鏡首次被用于觀察活體人眼。共聚焦顯微鏡成像之所以能在細胞水平上進行活體、無創、動態的觀察，得益于其分辨率高、放大倍數高、對比度高和穩定性強特點。近年來，共聚焦顯微鏡受到研究者青睞，被普遍應用于檢查結膜、淚膜、角膜及眼瞼等眼表系統病變。共聚焦顯微鏡檢查原理為：向檢查平面照射一束光線，使用探測儀器接收平面反射和折射光線，光線會在2個外側面(X，Y)和一個矢狀面產生分辨作用，據此得出光線散射情況及點擴散能力。因此，共聚焦顯微鏡能放大觀察病灶內組織細胞平面，通過計算機系統掃描形成病灶影像學資料，助力醫生觀察分析患者角膜病變情況。面對感染性角膜炎患者，共聚焦顯微鏡能動態觀察該患者角膜的各層結構及角膜病變情況，能為快速治療感染性角膜炎提供有力的影像證據。

共聚焦顯微鏡檢查有以下優勢[8-9]：(1)該方法是一種非侵入性、無須染色的活體角膜檢查。患者角膜不需直接接觸儀器鏡頭，而是通過涂抹保護角膜的耦合劑進行檢查，其在一定程度上可減少感染風險。(2)檢查時間短，全面檢查患者角膜情況僅需數十秒至幾分鐘。(3)該方法具有高分辨率，檢查所獲得影像資料具有較高的清晰度。(4)功能豐富，能測量角膜厚度，自動分析圖像和計算細胞數量。(5)該方法可以截取不同層面角膜組織影像，從組織學水平上展現角膜各層結構，從細胞學上觀察細胞形態結構和動態變化。(6)該方法具有可重復性，可在不同治療階段對感染性角膜炎患者進行檢查，有助于評估疾病進展和及時更新治療方案。

目前常用的共聚焦顯微鏡有三大類：串聯式、裂隙式和激光式，其中裂隙式和激光式較串聯式性能更佳、分辨率更高，因此使用更頻繁。

4 共聚焦顯微鏡在感染性角膜炎中的應用

共聚焦顯微鏡從細胞水平上直接觀察活體角膜的病理、生理學特點，不同的病原學感染有不同的特征[10]。共聚焦顯微鏡具有高分辨率，可直接用于觀察活體角膜組織中體積小至微米級的病原體，為診治感染性角膜炎提供了重要影像學證據，具有較大的臨床應用價值。近年來，應用共聚焦顯微鏡鑒別感染性角膜炎病原、病灶范圍深度、疾病發展階段、治療效果等取得了顯著成果[11-13]。

4.1細菌性角膜炎 引起細菌性角膜炎的細菌種類繁多、形態各異、體積細小，且病變范圍內常伴炎癥細胞浸潤，因此在共聚焦顯微鏡下常表現為不易分辨的高反光點[14-15]。其中，最常見的炎癥細胞是直徑為8～10 μm的粒細胞。為了更好地發現菌體，可以調整光源亮度，降低病灶區的背景反光亮度，從而突出菌體的高亮度反光點。

4.2真菌性角膜炎 在臨床工作中，醫生能利用共聚焦顯微鏡檢查觀察到真菌性角膜炎患者病變處的中性粒細胞、真菌菌絲和分生孢子。其中，在共聚焦顯微鏡下觀察到的真菌菌絲及孢子可分為以下3類：(1)樹枝狀菌絲。此類菌絲在共聚焦顯微鏡下的形態特征與光鏡下大同小異，通常可在角膜上皮層或基底細胞層觀察到直徑2～5 μm的樹枝狀菌絲。樹枝狀菌絲具有不同角度的分支，分支形態彎曲，粗細均勻，有時可觀察到分支間連接成網狀形態。(2)直、長線狀菌絲。在共聚焦顯微鏡下可觀察到此類菌絲形態長直、粗細均勻，其直徑為3～7 μm，多位于角膜淺、中基質層，可見菌絲分隔，周圍常伴高反光的炎癥細胞。(3)真菌孢子。在共聚焦顯微鏡下可觀察到真菌孢子呈圓形或橢圓形，直徑為10～15 μm，易與棘阿米巴的包囊混淆。檢查到典型的真菌孢子具有一定難度。有研究將共聚焦顯微鏡運用于真菌性角膜炎的病原學檢查時，可直接觀察到96.9%的患者病變處有真菌菌絲或孢子[16-18]。李紹偉等[19]研究顯示，運用共聚焦顯微鏡鑒別真菌性角膜炎具有一定臨床意義。KANAVI等[20]研究顯示，共聚焦顯微鏡的靈敏度和特異度分別高達94%、78%。目前能活體檢測角膜炎患者角膜浸潤深度的方法只有共聚焦顯微鏡檢查。角膜浸潤深度與治療方案的制訂及患者預后密切相關，根據此結果能評估患者是否應進一步行手術治療[21]。

4.3病毒性角膜炎 利用共聚焦顯微鏡觀察病毒性角膜炎患者的角膜，可見病變處出現體積增大的角膜上皮細胞，常伴大量樹突狀細胞浸潤。上皮層偶爾可見到微血管小支，此層神經叢數量常減少甚至消失。淺基質層常堆積大小不一、形態各異的高反光細胞，出現較多纖維甚至呈淺基質層纖維化。

4.4棘阿米巴角膜炎 近年來，棘阿米巴角膜炎患者越來越常見。AURAN等[22]于1994年首次報道用共聚焦顯微鏡觀察阿米巴性角膜炎的圖像特征。共聚焦顯微鏡可清晰觀察到典型的棘阿米巴原蟲包囊及滋養體大小、形態與結構。棘阿米巴包囊通常直徑大于細菌菌體，包囊、滋養體直徑分別為15～28、25～40 μm。位于上皮細胞間、上皮下及淺基質中的圓形白色閃光小體，即為典型的包囊[23-25]。包囊直徑l0～25 μm，體積常介于浸潤炎性細胞和上皮細胞之間，大多數具有雙層囊壁結構。MATHERS等[26]運用共聚焦顯微鏡觀察217例疑似阿米巴性角膜炎患者的角膜病灶，結果顯示，51例患者病原學檢測呈陽性，43例患者角膜刮片鏡檢呈陽性。PARMAR等[27]以63例疑似阿米巴性角膜炎患者為觀察對象，用共聚焦顯微鏡進行檢查，結果顯示54例患者病原學檢測呈陽性。研究表明，運用共聚焦顯微鏡診斷阿米巴角膜炎優于傳統的角膜刮片法，前者的靈敏度和特異度分別高達90.6%、100.0%[28-29]。輔助診斷阿米巴性角膜炎的重要方法包括共聚焦顯微鏡檢查和角膜刮片。角膜刮片對阿米巴包囊的檢出率較高，而滋養體在刮片的過程中易被破壞，不易檢出。角膜刮片能檢查上皮破損甚至形成潰瘍的角膜，但無法檢查完整的角膜上皮。該方法只能檢出位于角膜淺層的病原體，且無法定位檢查病原體的位置深度。共聚焦顯微鏡是一項可觀察早期上皮完整病變的無創性檢查，不僅能精準評估角膜浸潤深度，還能觀察病灶周圍組織情況。因此，共聚焦顯微鏡被廣泛應用于輔助診斷感染性角膜炎及評估患者治療效果與預后情況。阿米巴包囊在病變組織中存活時間長，最長可達31個月，因此，在控制棘阿米巴角膜炎患者的炎癥后，仍需繼續予藥物治療3～4個月，從而降低疾病復發率，避免疾病遷延不愈[30]。角膜上皮病變修復后，非侵入性的共聚焦顯微鏡檢查在評估患者預后情況方面具有不可比擬的優勢。

4.5共聚焦顯微鏡在感染性角膜炎中的鑒別診斷

4.5.1真菌性角膜炎和細菌性角膜炎的鑒別 真菌性角膜炎患者的病灶區有時可觀察到真菌菌絲及孢子，且可觀察到以中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，體積較多形核白細胞小；細菌性角膜炎病灶區可見菌體表現為直徑1～2 μm的高反光點，浸潤的炎癥細胞主要為直徑為8～10 μm的多形核白細胞[31-33]。

4.5.2真菌菌絲與角膜基質神經及纖維條索的鑒別 當病變角膜組織修復時，角膜基質可產生一些神經及纖維條索，易與菌絲混淆。因此應根據以下特點進行鑒別：(1)體積大小。真菌菌絲體積小，一般直徑小于6 μm；而角膜基質神經及纖維條索體積大，直徑為10～15 μm。(2)形態特征。在暗背景下可觀察到真菌菌絲彌漫分布，呈點狀、線狀、樹枝狀或交織成網狀的高反應形態，常見菌絲分隔、邊界清楚且具有一定的生理彎度；纖維條索具有呈“Y”形分支，上下垂直走行的分布規律，邊界模糊且形態長直。(3)反光度及炎癥細胞數量。菌絲常反光度高于神經纖維條索，周圍常見炎癥細胞浸潤，而纖維條索周圍炎性細胞少。

4.5.3角膜活化細胞與短段狀菌絲的鑒別 運用共聚焦顯微鏡檢查，可見角膜活化細胞常位于真菌性角膜炎的角膜組織中，周圍常見尖角形、棒狀正常角膜細胞。活化的角膜細胞核伸長，表現為長度小于30 μm的梭形形態，細胞排列不具備一定的規律，應仔根據鏡下特征的差異，與短、段狀菌絲鑒別。

4.5.4真菌孢子與棘阿米巴包囊的鑒別 可根據以下特點鑒別形態相似的真菌孢子和不典型棘阿米巴包囊：(1)體積大小。通過用共聚焦顯微鏡觀察不同類型的病原體，發現真菌孢子的體積略小于棘阿米巴包囊。(2)綜合分析。多數棘阿米巴角膜炎患者有角膜接觸鏡佩帶史，鏡下可見腫脹增粗的角膜神經纖維，且患者常伴有放射性神經炎。

5 共聚焦顯微鏡的局限性

5.1患者配合度影響 檢查患者角膜病變情況需準確定位。若患者配合度高，則有助于共聚焦顯微鏡檢查，反之，各平面圖像的位置極易產生偏差。遇到老年人、兒童及有眼球震顫患者時，應尋找適當的方法提高患者配合度。

5.2角膜透明度、干燥程度影響 影響激光穿透角膜的重要因素包括角膜透明度。若角膜水腫致透明度明顯下降，共聚焦顯微鏡的激光難以穿越角膜，則無法形成清晰的深層組織圖像。反之，若角膜過于干燥會降低圖像質量。因此，為了提高共聚焦顯微鏡檢查的清晰度及準確性，不僅要提高檢查者的技巧，如適當調整背景圖的亮度、選擇病灶中心及多個觀察點，還必須提高患者配合程度，根據病情需要滴用人工淚液等，從而為感染性角膜炎的診治提供影像學證據。

6 小結與展望

共聚焦顯微鏡是溝通眼表疾病基礎研究與臨床應用的重要橋梁，其為活體進行眼表疾病細胞水平的病理診斷帶來了革命性變化。利用共聚焦顯微鏡不僅能觀察和分析病原菌、炎癥細胞及角膜基質細胞等綜合因素，鑒別不同的病原，還可以判斷病灶發展的深度，客觀評價疾病嚴重程度，預測疾病轉歸，在角膜感染的無創快速診斷及治療中具有不可比擬的優越性。但是，共聚焦顯微鏡的研究與應用仍面臨諸多挑戰，仍需加強其在安全性、可重復性及自動檢測方面的功能。目前，可通過儀器自帶軟件對角膜內皮細胞密度進行自動分析，但仍需人工操作相關軟件對神經纖維等進行描繪和計數，產生的主觀偏倚會影響數據結果。此外，現有共聚焦顯微鏡成像均為不同亮度的黑白反光點，在分辨大小、形態相似的組織時存在一定難度，如各種白細胞等。