血清LTD4在非酒精性脂肪性肝病診斷中的臨床意義*

孫立平，朱繼寶，孫立珍

(首都醫(yī)科大學(xué)密云教學(xué)醫(yī)院:1.感染性疾病科;2.檢驗(yàn)科，北京 101500)

目前，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)在全世界的發(fā)生率逐漸升高，影響了全世界約1/4的人群[1]，嚴(yán)重危害了公眾健康。NAFLD包括一系列肝臟疾病，從非酒精性脂肪肝(NAFL)到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，最終可能導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌[2]。從2015年到2030年，美國(guó)NAFLD患者預(yù)計(jì)將增加21%，從8 310萬(wàn)例(2015年)增加到1.009億例(2030年)，NASH患者數(shù)將從1 652萬(wàn)例增加到2 700萬(wàn)例[3]。NASH是由脂肪積累而造成肝細(xì)胞損傷，同時(shí)伴有肝臟炎癥形成的疾病,其典型特征是肝臟組織學(xué)上的改變，包括脂肪變性、小葉炎癥、伴或不伴竇周纖維化的氣球樣變[1]。細(xì)胞膜磷脂發(fā)生病理、生理改變時(shí)可出現(xiàn)花生四烯酸(AA)的氧化物；AA經(jīng)脂氧合酶(LOX)代謝途徑后產(chǎn)生的物質(zhì)包括白三烯(LT)；LTD4作為炎性趨化因子中作用最強(qiáng)的半胱氨酰LT分子，是由AA經(jīng)5-LOX途徑代謝生成的一類重要炎癥介質(zhì)[4]。研究已經(jīng)證實(shí)，LTD4在原發(fā)性肝癌中會(huì)過(guò)度表達(dá)[4]，同時(shí)作為重要的炎癥介質(zhì)，參與了多種炎性反應(yīng)過(guò)程。當(dāng)NAFLD患者肝臟發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)，是否也有LTD4的表達(dá)呢？目前有關(guān)檢測(cè)NAFLD患者體內(nèi)LTD4的報(bào)道較少見(jiàn)。本研究分析了NAFLD患者血清LTD4水平變化情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年9月至2020年6月本院肝病門診NAFLD患者46例作為研究對(duì)象，根據(jù)疾病類型將其分為NASH組(25例)和NAFL組(21例)。同時(shí)選取15例健康志愿者作為對(duì)照組。診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合《非酒精性脂肪肝性肝病診療指南(2010年修訂版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：各種肝炎、自身免疫性疾病、糖尿病等可能影響LTD4水平的疾病。3組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組一般資料比較

1.2方法 于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血5 mL至未加抗凝劑的紅頭管內(nèi)，經(jīng)離心后，留取血清1 mL，并置于-80 ℃冰箱保存。將標(biāo)本送至本院檢驗(yàn)科檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。血清LTD4采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗體夾心法檢測(cè)，檢測(cè)試劑盒由上海研謹(jǐn)生物科技有限公司提供，嚴(yán)格遵照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。(1)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；(2)樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL，空白孔不加；(3)除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min；(4)棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次；(5)每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min；(6)每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值。

2 結(jié) 果

2.13組ALT、AST水平比較 3組ALT、AST水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NASH組ALT、AST水平均高于NAFL組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 3組ALT、AST水平比較

2.23組血清LTD4水平比較 NASH組血清LTD4水平為(676.86±74.01)ng/mL，明顯高于NAFL組和對(duì)照組的(462.20±54.51)、(475.11±38.51)ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NAFL組血清LTD4水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3血清LTD4診斷效能分析 血清LTD4診斷NASH的曲線下面積為0.996(95%CI為0.987～1.000，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 ROC曲線

2.4LTD4水平與ALT、AST水平相關(guān)性分析 在NASH患者中，LTD4水平與ALT、AST水平無(wú)相關(guān)性(r=0.115、0.090，P>0.05)。

3 討 論

目前，全球NAFLD發(fā)生率可達(dá)25%，其中59%會(huì)進(jìn)展為NASH[5]，而且NAFLD可直接導(dǎo)致失代償期肝硬化和肝細(xì)胞癌，嚴(yán)重危害人類健康[6]。NASH患者發(fā)生肝硬化的概率是單純性脂肪變的11倍[7]。研究表明，與健康人群相比，NAFLD患者平均壽命縮短4～10年，主要與NAFLD所導(dǎo)致的惡性腫瘤、心腦血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)[8]。近年來(lái)對(duì)于NAFLD的發(fā)病機(jī)制還未完全闡明，越來(lái)越多的NASH相關(guān)肝損害研究指出，細(xì)胞因子和炎性因子介導(dǎo)肝臟的慢性炎性反應(yīng)[9]。LTD4是花生四烯酸在白細(xì)胞中代謝后的產(chǎn)物，不僅直接參與了炎癥過(guò)程的調(diào)控，而且還具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等功能[10]。

NASH是NAFLD的活動(dòng)形式，是發(fā)生慢性肝病并發(fā)癥的最大風(fēng)險(xiǎn)。ALT與AST分別存在于肝細(xì)胞和肝細(xì)胞的線粒體中。循環(huán)血液中ALT與AST的水平升高說(shuō)明肝細(xì)胞發(fā)生炎性壞死，肝細(xì)胞內(nèi)的ALT、AST溢出細(xì)胞外進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致了外周血液中ALT、AST水平升高。本研究結(jié)果顯示，NASH組ALT、AST水平明顯高于NAFL組和對(duì)照組。提示NASH患者具有肝細(xì)胞損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，免疫相關(guān)炎癥的變化在NAFLD的發(fā)病機(jī)制中起著非常重要的作用[11]。NASH患者肝細(xì)胞發(fā)生了炎性反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生很多重要的炎癥介質(zhì)，而LTD4就是其中之一。本研究結(jié)果顯示，3組血清LTD4水平比較，NASH組最高，且NAFL組和對(duì)照組血清LTD4水平無(wú)明顯差異。提示NASH患者體內(nèi)LTD4呈高水平表達(dá)狀態(tài)，其參與了NASH患者肝臟的炎性反應(yīng)。LTD4是某些變態(tài)反應(yīng)及炎癥疾病中的化學(xué)介質(zhì)，在機(jī)體出現(xiàn)炎性反應(yīng)時(shí)，LTD4水平會(huì)顯著提高[12]。肝臟的炎性反應(yīng)主要是由浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等，以及大量促炎性細(xì)胞因子和趨化因子共同作用的結(jié)果。LT由LTB4和半胱氨酰(包括LTC4、LTD4和LTE4)組成。肝臟的Kupffer細(xì)胞、肥大細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也可以產(chǎn)生LT，而且在肝內(nèi)LTC4經(jīng)過(guò)LTD4代謝為L(zhǎng)TE4，而肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞是否合成LT目前尚不清楚。LTD4作為重要的炎癥介質(zhì)，一方面可能引發(fā)肝細(xì)胞損傷，促進(jìn)癌變；另一方面，在炎癥的加劇方面扮演了重要的角色。

本研究結(jié)果顯示，血清LTD4診斷NASH的曲線下面積為0.996。提示LTD4在NASH的診斷中具有重要意義。此外，本研究結(jié)果還顯示，LTD4水平與ALT、AST水平無(wú)相關(guān)性，這與張繼舜等[12]研究結(jié)果不一致，與ZHOU等[13]研究一致。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LTD4在細(xì)菌內(nèi)毒素及病毒的協(xié)同作用下可導(dǎo)致肝細(xì)胞損害[14]。而NAFLD與原發(fā)性肝癌沒(méi)有這些誘因。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，單純LTD4僅對(duì)肝細(xì)胞造成輕度損傷，但其又可顯著促進(jìn)D-氨基半乳糖的肝細(xì)胞毒性作用，從而誘發(fā)急性肝損害[14]。因此，在NASH患者血清中，LTD4水平升高的原因可能為肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)經(jīng)氧化應(yīng)激后導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，繼而發(fā)生的炎性反應(yīng)導(dǎo)致了LTD4水平升高，同時(shí)高水平LTD4又可導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[12-13]。LTD4對(duì)肝細(xì)胞的損傷程度不一，因此NASH患者LTD4水平的高低與患者肝功能水平?jīng)]有明顯關(guān)系，其在血清中的表達(dá)量不能判斷肝細(xì)胞損傷情況。LTD4是否對(duì)病情的發(fā)展及預(yù)后尤其是對(duì)肝癌的進(jìn)展有意義仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，NAFLD患者肝臟發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)，即NAFLD進(jìn)展為NASH時(shí)，患者體內(nèi)LTD4水平會(huì)顯著升高，這對(duì)NASH的診斷及評(píng)估具有重要意義。但是LTD4與肝硬化和肝癌的進(jìn)展是否有關(guān)系，還需要大量的臨床樣本和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。