培養(yǎng)基對抗生素效價測定的影響

林常定

（文山州食品藥品檢驗研究院微生物檢測科 云南 文山 663099）

當(dāng)前測量抗生素效價作為微生物的主要鑒定方式，是關(guān)鍵的檢測的測量方法[1]。當(dāng)前影響抗生素效價測量的因素較多，包括儀器精準(zhǔn)度、培養(yǎng)基等因素，且微生物的生長繁殖都需具備一定的條件，才能滿足實際的需求[2]。基于此，本文針對培養(yǎng)基對抗生素的效價測定影響進(jìn)行分析，并簡單概述抗生素效價測量過程中各項影響因素，詳細(xì)內(nèi)容如下。

2.結(jié)果

實驗結(jié)果顯示，對抗生素使用不同培養(yǎng)基進(jìn)行測定時，同一生產(chǎn)商家的培養(yǎng)基對一個樣品進(jìn)行多次測量的結(jié)果，兩次測量結(jié)果之間的數(shù)據(jù)差1%～5%，而不同商家的培養(yǎng)基測量數(shù)據(jù)時，其數(shù)據(jù)差大于5%。詳細(xì)見表1、表2。

表1 培養(yǎng)基與供試樣品

表2 效價測定結(jié)果（%）

1.資料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品、實驗用菌液制備

標(biāo)準(zhǔn)品：慶大霉素：采用經(jīng)中國藥品生物制品檢定所批準(zhǔn)后的慶大霉素進(jìn)行實驗，慶大霉素批號為130326-200314。

試驗品應(yīng)用菌液的制備：實驗菌主要采用短小芽孢桿菌懸浮液，采用普通瓊脂斜面培養(yǎng)物，并添加滅菌0.9%氯化鈉溶液將菌苔洗下，隨后制作成懸浮液，使用吸管將其放置盛有培養(yǎng)基的大試管斜面內(nèi)，讓其在37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)一周。一周后獲取菌苔涂片，對其進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，保證芽孢在85%以上，并使用滅菌水將芽孢清洗下去，隨后制成芽孢懸浮液，將其轉(zhuǎn)移至滅菌大試管內(nèi)，讓其在70 ℃環(huán)境下，對其加熱30 min 后，將芽孢懸浮液移動至滅菌離心管內(nèi)，對其離心處理后，獲得懸浮液。將懸浮液轉(zhuǎn)移至滅菌試管內(nèi)，在此將其放置于70 ℃環(huán)境下水浴加熱30 min，并放置在4 ～8 ℃環(huán)境內(nèi)保存，其可以使用6 ～12 個月。

1.2 培養(yǎng)基、供試樣品

培養(yǎng)基采用青島海博生物生產(chǎn)的抗生素培養(yǎng)基以及進(jìn)出口商品檢驗技術(shù)研究所采購的抗生素培養(yǎng)基。實驗應(yīng)用的抗生素樣品包括四種不同廠家的慶大霉素藥物，分別為山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司生產(chǎn)的硫酸慶大霉素注射液（國藥準(zhǔn)字H370224046）、湖北廣濟(jì)藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的硫酸慶大霉素顆粒（國藥準(zhǔn)字H42022713）、重慶迪康長江制藥有限公司生產(chǎn)的硫酸慶大霉素膠囊（國藥準(zhǔn)字H50021682）、江蘇平光制藥（焦作）有限公司生產(chǎn)的硫酸慶大霉素片（國藥準(zhǔn)字H20023352）。

3.討論

抗生素含量測量的主要方法是微生物測量方法，且各個藥物均具有一定的記載[3]。微生物檢測的方法直接關(guān)系到使用人員的安全性以及有效性，且檢測原理與臨床醫(yī)療的要求相似，可以代表抗生素對微生物產(chǎn)生的作用，進(jìn)而保證實驗結(jié)果更加準(zhǔn)確[4]。

3.1 培養(yǎng)基

微生物檢定法中培養(yǎng)基的質(zhì)量具有十分重要的地位，其不僅影響細(xì)菌的生長繁殖，還會降低抗生素的實際濃度，進(jìn)而影響抗生素的擴(kuò)散系數(shù)以及時間[5]。此種情況下，抗生素的抑菌圈直徑大小以及邊緣清晰度、實驗結(jié)果準(zhǔn)確性，都會影響實際的情況。培養(yǎng)基成品中主要以陳和瓊脂培養(yǎng)基的影響最大，故對抗生素進(jìn)行效價檢測之前，需選擇品牌一致的生產(chǎn)商進(jìn)行實驗[6]。

同時，抗生素培養(yǎng)基微生物檢定過程中，常使用固體培養(yǎng)基等。成品抗生素培養(yǎng)基的PH 數(shù)值普遍偏低，進(jìn)而對細(xì)菌生長速度以及抗生素的擴(kuò)散產(chǎn)生一定的影響。相關(guān)文獻(xiàn)研究，部分抗生素，尤其是包含氨基糖苷類抗生素可以通過增加培養(yǎng)基的酸堿度，提高檢測準(zhǔn)確度。比如，磷霉素的微生物檢測方法的酸堿數(shù)值為9.0 的培養(yǎng)基，可以在不改變其他檢測條件下，檢測結(jié)果滿足微生物檢測要求，保證實際檢測的結(jié)果。

3.2 實驗用菌影響

首先，實驗需保證菌種優(yōu)化。實驗人員合理選擇菌種，是建立微生物生物檢定法的關(guān)鍵方法，其具有一定的臨床特定，其對抗生素具有敏感、穩(wěn)定等特點，且具有易于保存、培養(yǎng)等特點。處于此種情況下，實驗人員需要挑選具有典型癥狀的單個菌落，并對其進(jìn)行分離純化培養(yǎng)等措施。為了保證菌種的新鮮程度，需每間隔2 ～3 周對其進(jìn)行1 次傳代處理。針對不常使用的菌種，其接種時，需固定在半固定體培養(yǎng)基內(nèi)或進(jìn)行凍干保存。

其次，實驗菌群的菌齡對于抑菌圈的邊緣清晰程度具有密切的聯(lián)系。部分學(xué)者對這一內(nèi)容進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)天菌的抑菌圈邊緣較清晰，15 d 菌齡的抑菌圈邊緣也比較清晰，30 d 菌齡的抑菌圈邊緣也尚可，5 mo 菌齡的抑菌圈邊緣則不清晰。使用菌液對其進(jìn)行清洗之后，將其放置與滅菌注射用水中，不超過3 mo 為宜。若在應(yīng)用菌群的過程中，發(fā)現(xiàn)抑菌圈邊緣不夠規(guī)整，可以用65 ℃對其進(jìn)行加熱，進(jìn)而獲得滿意的效果。

最后，培養(yǎng)基溫度比較高會殺滅一些試驗菌群，進(jìn)而導(dǎo)致抑菌圈發(fā)生破裂的情況。通常情況下，菌群培養(yǎng)基的溫度需控制在65 ～70 ℃，球菌培養(yǎng)基的溫度需控制在48 ～50 ℃，霉菌培養(yǎng)基的溫度則不宜超過48 ℃。

3.3 緩沖液pH 影響

緩沖液的pH 濃度只作為控制抑菌圈大小以及清晰度的關(guān)鍵條件。正常情況下，堿性抗生素在偏堿性緩沖液條件下其具有較強(qiáng)的抗菌液，酸性抗生素處于偏酸性條件下的抗菌活性比較強(qiáng)。氨基糖苷類以及大環(huán)內(nèi)酯類等堿性抗生素，需選用偏堿性的緩沖液，以此提高抗生素的抗菌活性。比如，慶大霉素的微生物檢測過程中，高劑量的抑菌圈直徑常不到18 ～24 mm，且高低直徑抑菌圈直徑相差比較小，且抑菌圈邊緣欠清晰，對其使用卡尺進(jìn)行測量，無法保證實際的誤差，更不能對抑菌面積測量分析儀器進(jìn)行直接的測量。

3.4 培養(yǎng)溫度影響

藥典對抗生素的培養(yǎng)溫度以及時間均有詳細(xì)的記錄，培養(yǎng)的溫度過高或者過低的時候，都會影響抑菌圈的大小以及完整度。通常，靠近孵化箱較近一側(cè)培養(yǎng)基上的細(xì)菌，其生長速度較快。此種情況下，極易出現(xiàn)局部生長速度不平衡的情況，且抑菌圈比較小。

3.5 測量結(jié)果影響

測量抑菌圈直徑是獲得時間結(jié)果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)前，國內(nèi)抗生素培養(yǎng)基結(jié)果測量，常使用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量，并在測量過程中，保持視線與讀數(shù)刻度垂直，以此保證讀數(shù)的準(zhǔn)確性。并且，反復(fù)多次測量一個抑菌圈之后，需要將卡尺退回至零點或者進(jìn)行移動，隨后測量兩個抑菌圈，避免發(fā)生主觀上的視覺錯誤，進(jìn)而影響客觀數(shù)據(jù)。同時，使用卡尺進(jìn)行測量的過程中，可以采用十字交叉測量方法，對每個抑菌圈進(jìn)行兩次垂直測量，獲得平均數(shù)值，且兩次測量之間的抑菌圈直徑數(shù)據(jù)差不能超過0.1 mm。

3.6 標(biāo)準(zhǔn)品影響

抗生素生物檢定法應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)品的性質(zhì)，主要是根據(jù)抗生素的效價精準(zhǔn)度以及性質(zhì)，對其進(jìn)行合理的判定。部分制劑內(nèi)含有較大抗菌活性的添加劑，需在添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液內(nèi)，添加相同數(shù)量添加劑，以此消除測定對產(chǎn)生的影響。一些對光敏感或者在水溶解度比較差的抗生素。實驗人員在實際制備的過程中，還需注意避光措施，以此保證溶液以及供試液中所含濃度相同，降低影響。

綜上所述，在抗生素微生物檢定法實驗中，從標(biāo)準(zhǔn)品、供試品等各個環(huán)節(jié)，直至培養(yǎng)基、緩沖液配置以及實驗菌種等操作中，實驗人員需嚴(yán)格遵守操作規(guī)范。實驗人員在實際工作中，經(jīng)常會碰到抑菌圈破裂、卵圓形、橢圓形等情況。通過對其進(jìn)行多個方面的分析后，可以重新選擇一個批號或者另一廠家的培養(yǎng)基，進(jìn)而保證實驗結(jié)果的滿意度。同時，實驗操作人員在配置過程中，培養(yǎng)基以及緩沖液內(nèi)的純化水也具有關(guān)鍵作用。由于各地水質(zhì)的酸堿程度不一樣，需根據(jù)藥典規(guī)定嚴(yán)格制定合理的內(nèi)容，進(jìn)而保證實驗數(shù)據(jù)有效。比如，氨基糖苷類抗生素檢測過程中，培養(yǎng)基、緩沖液等酸堿程度對抑菌圈的影響比較大，酸堿程度比較高培養(yǎng)基，獲得抑菌圈則越小。因此，針對檢測效價處于合格、不合格邊緣的抗生素藥品，需要更換廠家、批號對其進(jìn)行實驗，隨后對實驗結(jié)果展開對比，獲得精準(zhǔn)的實驗數(shù)據(jù)內(nèi)容。