川明參中葡聚糖的分離純化、結構表征及抗氧化活性研究

高濤,羅黃洋,吳韌,程飛,賀靈芝,2,唐玲玲,唐華麗*,聶青玉

1(重慶三峽學院 生物與食品工程學院,重慶,404100)2(重慶市萬州區(qū)食品藥品檢驗所,重慶,404100) 3(重慶三峽職業(yè)學院 農林科技學院,重慶,404100)

植物多糖作為一種高分子化合物,不僅參與細胞的各種生理生化反應,同時也具有免疫調節(jié)[1]、抗腫瘤[2]、降血糖等生物活性[3-4]。與此同時,也是天然抗氧化劑的重要來源[5-6]。川明參是我國特有的傘形科多年生草本植物,主要分布于四川與湖北等地,富含多糖、香豆素、氨基酸及脂肪酸等物質[7-10]。川明參作為一種傳統(tǒng)中藥,被廣泛應用于藥膳制作,具有深遠的食用歷史。多糖作為川明參中主要的活性成分,具有較好的增強免疫[11-12]、抗病毒[13]、抗氧化[14-15]等性質。

研究表明,川明參多糖能在RAW 264.7巨噬細胞模型、小鼠脾臟細胞模型及環(huán)磷酰胺誘導的免疫力低下小鼠模型中表現(xiàn)出較好的免疫活性[16-18];硫化川明參多糖可通過阻斷鴨腸炎病毒吸附宿主細胞來抵抗鴨腸炎病毒[13];川明參多糖以及硒化川明參多糖可作為佐劑來提高口蹄疫病毒疫苗及乙肝病毒疫苗的免疫應答[19-20]。另外,體外抗氧化實驗表明,川明參多糖具有較好的ABTS陽離子自由基以及DPPH自由基清除能力[14-15]。此外,FAN等[21]的研究表明,川明參多糖能顯著提高D-半乳糖致衰老小鼠的Cu/Zn-超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、Mn-SOD、Fe-SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和重組抗氧化酶的mRNA表達水平,以此來提高這些酶的活性,實現(xiàn)川明參多糖的體內抗氧化作用。最新的研究表明,川明參多糖的抗氧化活性及其免疫活性可能與其α-1,4-GalA有關[12]。

近年來,盡管在川明參多糖的生物活性方面有了大量的報道,但其結構方面的研究還較為淺顯。目前,對川明參多糖的結構的研究還處于單糖組成及分子質量等方面的研究,糖苷鍵組成及連接方式等鮮有報道。本文采用超聲輔助水提醇沉法提取川明參粗多糖,并采用離子色譜、凝膠滲透色譜(high-performance gel filter chromatography,HPGPC)、紫外光譜、傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)和核磁共振光譜對凝膠柱層析后的主要組分進行結構鑒定。此外,以ABTS陽離子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、·OH清除能力、Fe2+螯合能力及總還原力為指標考察其抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川明參,重慶市萬州區(qū);葡聚糖凝膠G-150和單糖標品(葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、巖藻糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸),美國Sigma公司。其余均為國產分析純試劑。

1.2 儀器及設備

UV-2450紫外可見光分光光度計、LC-10A高效液相色譜儀,日本島津公司;FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀,天津港東科技股份有限公司;ALPH1-2/LD-Plus冷凍干燥機,德國CHRIST公司;高壓離子色譜儀,美國賽默飛公司;Bruker DRX-400核磁共振波譜儀,德國Bruker公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 川明參粗多糖的提取

稱取一定量川明參粉置于2 000 mL錐形瓶中,按料液比1∶20(g∶mL)加入蒸餾水溶解。在300 Hz、60 ℃條件下,將溶解液放入超聲清洗儀中超聲提取90 min。超聲完成后用4層紗布過濾,然后將濾液濃縮至原體積的1/4,向濃縮液中加入體積分數為80%的乙醇沉淀。靜置過夜,離心收集沉淀,沉淀經真空冷凍干燥得到粗多糖粉末。

1.3.2 川明參粗多糖的分離純化

取一定量粗多糖粉末配制成10 mg/mL溶液,采用Sevag法除去游離蛋白。按3∶1的體積比例向川明參粗多糖溶液加入氯仿-甲醇溶液(V∶V=4∶1),劇烈振蕩30 min后離心,利用分液漏斗收集上層液體。重復6次后加入無水乙醇并調節(jié)乙醇體積分數為80%。靜置過夜,離心收集沉淀并冷凍干燥。將除蛋白后的樣品用去離子水配制成質量濃度為10 mg/mL的樣品溶液。采用Sephadex G-150 (2.5×60 cm)進行分離純化。上樣量為5 mL,流速1 mL/min,采用自動收集器每10 min收集一管濾出液。再采用苯酚-硫酸法在490 nm處測定濾出液中的多糖含量,并繪制洗脫圖。根據洗脫曲線收集主要組分以備后續(xù)分析。

1.3.3 川明參多糖主要成分的結構表征

1.3.3.1 單糖組成

色譜條件:DionexTMCarboPacTMPA10色譜柱(250 mm×4.0 mm×10 μm);ICS-5000+型高壓離子色譜儀(配備電化學檢測器);上樣量為20 μL;流速為0.5 mL/min;柱溫30 ℃;流動相A:去離子水;流動相B:100 mmol/L的NaOH溶液;采用梯度洗脫模式:0～30 min 2.5% B上升至20 %，30～30.1 min 20% B上升到40 %，30.1～45 min 40% B等度洗脫，45～45.1 min 40% B下降至2.5%，45.1～60 min 2.5% B等度洗脫。

1.3.3.2 分子質量測定

采用HPGPC法測定分子質量[23]。精密稱取5 mg樣品溶于1 mL濃度為0.05 mol/L的NaCl溶液中(超純水配制),超聲溶解后于12 000 r/min離心10 min,取上清液過0.22 μm水系濾膜后進行上機分析。

色譜條件:LC-10A型高效液相色譜(配備RI-502示差檢測器);BRT-105-102(8 mm×300 mm)串聯(lián)色譜柱;上樣量為20 L;流速為0.6 mL/min;柱溫40 ℃;流動相為0.05 mol/L的氯化鈉溶液。

1.3.3.3 紫外及紅外光譜掃描

制備不同濃度的多糖溶液于波長200～600 nm處進行紫外光譜掃描。稱取1～2 mg多糖粉末,置于瑪瑙研缽中,加入150～200 mg干燥后的KBr晶體,研磨均勻后壓片,在4 000～400 cm-1記錄其紅外光譜。

1.3.3.4 核磁分析

稱取適量多糖樣品溶解于99.9%的D2O中,并使用Bruker DRX-400核磁共振波譜儀測定樣品1H譜及13C譜,再測定樣品的HSQC,COSY以及HMBC光譜。核磁數據采用MestRanova software進行分析。

1.3.4 川明參多糖主要成分的結構表征

參考文獻[24-26]的方法，對多糖樣品的ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、·OH清除活性、Fe2+螯合能力以及總還原力等體外抗氧化活性指標進行考察。

1.4 數據分析

每組實驗重復3次,結果采用X±SD表示。繪圖采用Origin 2018軟件,采用SPSS 23.0軟件并根據Probit回歸模型計算半抑制濃度(IC50)。

2 結果與討論

2.1 川明參多糖的分離純化

川明參粗多糖經Sevag法除去蛋白后,將其溶于去離子水中,采用Sephadex G-150進行分離純化。洗脫曲線如圖1所示,川明參粗多糖經凝膠柱層析后得到3個組分,將其分別命名為CVPs-I、CVPs-II和CVPs-III。經比較發(fā)現(xiàn),CVPs-III為其主要組分。對其收集后進行后續(xù)檢測。

圖1 川明參多糖的Sephadex G-150洗脫曲線Fig.1 The elution curve of C.violaceum polysaccharides with Sephadex G-150

2.2 CVPs-III的結構鑒定

2.2.1 單糖組成及分子質量分析

采用離子色譜法分析CVPs-III的單糖組成。其結果如圖2-a所示,CVPs-III主要由葡萄糖組成。根據其單糖組成結果推斷CVPs-III可能為葡聚糖。有文獻報道川明參多糖多由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖及木糖組成,與CVPs-III在單糖組成上存在較大差異[12,19-20]。LIN等[12,27]研究表明,不同產地間的川明參多糖的單糖組成不同,這種差異可能是樣品的生長環(huán)境不同引起的。此外,由于本研究所采用的單糖組成測定方法與已報道的文獻所述方法不同,這也可能是單糖組成差異較大的原因。

采用HPGPC法測定CVPs-III的分子質量,其結果如圖2-b所示。CVPs-III的重均分子質量(Mw)和分布系數(Mw/Mn)分別為176 kDa和1.05,與文獻中報道的川明參多糖的分子質量相似[20]。

a-單糖組成;b-分子質量圖2 CVPs-III的單糖組成與分子質量Fig.2 The monosaccharide content and molecular weight of CVPs-III

2.2.2 紫外光譜及紅外光譜解析

CVPs-III的紅外光譜及紫外光譜如圖3所示。紫外光譜中,在260～280 nm處無明顯吸收,這表明CVPs-III中不含蛋白質和核酸[28]。紅外光譜中,3 405 cm-1處的吸收峰為分子間和分子內的O—H伸縮振動引起的[29];2 925 cm-1處的吸收峰為多糖的C—H伸縮振動峰,此為多糖的特征吸收峰[30];1 640 cm-1處的吸收峰為結合水的特征吸收峰[31];1 417 cm-1處的吸收峰為多糖的C—O伸縮振動[32];1 000～1 200 cm-13個吸收峰表明CVPs-III主要由吡喃糖構成[33];932和852 cm-1處的吸收峰表明CVPs-III既含有α-吡喃糖苷鍵,也有β-吡喃糖苷鍵[34]。

a-紫外光譜;b-紅外光譜圖3 CVPs-III的紫外光譜及紅外光譜分析Fig.3 The UV and FI-IR spectra of CVPs-III

2.2.3 核磁共振光譜分析

采用一維及二維核磁技術可對多糖的糖殘基組成及連接方式進行分析[35-37]。CVPs-III的核磁數據如圖4和圖5所示。由圖4與圖5-a中的異頭碳氫質子信號可知,CVPs-III可能由5種糖殘基組成,其異頭碳氫質子信號依次為98.61/5.29、99.99/5.26、98.45/4.86、95.70/4.53和103.16/4.53 ppm,并將其分別標記為殘基A、B、C、D和E。此外,根據圖5-b和圖5-c可對各殘基的δ H2/C2-H6/C6進行推斷,其結果如表1所示。殘基A的C1和C4均向低場方向移動,表明殘基A的C1與C4位置均發(fā)生了取代。因此,根據文獻以及CVPs-III的單糖組成,推斷殘基A可能為→4)-α-Glcp-(1→[38-42]。依次類推,殘基B、C、D和E分別為→4,6)-α-Glcp-(1→[38-42]、α-Glcp-(1→[38-41]、→4)-β-Glcp[40,42]、→3)-β-Glcp-(1→[41]。

由于HMBC光譜上包含異頭氫與其他糖殘基上碳的耦合信號,異頭碳與其他糖殘基上氫的耦合信號,故糖苷鍵連接方式可通過HMBC光譜進行確定。CVPs-III的HMBC譜如圖5-c所示,殘基A的C1與H4之間存在耦合信號;殘基A的H1和C4之間存在耦合信號,故推測殘基A之間可能是通過(1→4)糖苷鍵進行連接。此外,殘基A的C1與殘基B的H4之間存在耦合信號,殘基A的H1與殘基B的C4之間存在耦合信號,殘基B的C1與殘基A的H4之間存在耦合信號,殘基B的H1與殘基A的C4之間存在耦合信號,故推測殘基A與殘基B之間也是通過(1→4)糖苷鍵進行連接。另外,殘基A的H1與殘基E的C3存在耦合信號,推測殘基A可通過(1→3)糖苷鍵與殘基E連接;殘基E的C1與殘基A的H4之間存在耦合信號,推測殘基E 可通過(1→4)糖苷鍵與殘基A連接。綜上所述,考慮到各糖殘基在核磁圖中信號的強弱,并結合文獻中報道的葡聚糖的核磁光譜,推測CVPs-III的主鏈主要由→4)-α-Glcp-(1→4)-α-Glcp-(1→構成,并含有少量的→4)-α-Glcp-(1→3)-β-Glcp-(1→4)-α-Glcp-(1→[38-42]。

表1 殘基A-G的化學位移Table 1 The chemical shifts and coupling constant of residue A-G

2.3 抗氧化活性鑒定

自由基作為人體內正常代謝的產物,一般情況下處于動態(tài)平衡中,但平衡一旦被打破后,由于其狀態(tài)極不穩(wěn)定,會攻擊鄰近分子(碳水化合物、蛋白質、脂質等)以奪取電子。所以,過多的自由基會導致細胞結構破壞、功能喪失、造成細胞損傷或死亡[43-45]。另外,過多的自由基也是心血管疾病、糖尿病、慢性炎癥、神經退行性疾病、風濕病與癌癥等慢性疾病和老年病的原因之一[46-48]。因此,采用ABTS陽離子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、·OH清除能力、Fe2+螯合能力及總還原力對川明參多糖的體外抗氧化活性進行考察。

川明參粗多糖及其純化組分的體外抗氧化活性如圖6所示。川明參粗多糖及其純化組分均具有較好的體外抗氧化活性,其ABTS陽離子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、·OH清除能力、Fe2+螯合能力及總還原力均表現(xiàn)出劑量效應關系。如圖所示,CVPs-III的抗氧化活性最高,其次是CVPs、CVPs-II和CVPs-I。利用SPSS軟件并通過Probit回歸模型所計算得到CVPs-III的ABTS陽離子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、Fe2+螯合能力和·OH清除能力的IC50分別為(1.392±0.006)、(0.596±0.017)、(0.554±0.001 1)、(0.618±0.018)mg/mL。

與文獻報道的超聲輔助和微波輔助提取的川明參多糖的ABTS陽離子自由基清除能力相比,CVPs-III的ABTS陽離子自由基清除能力較低,但DPPH自由基清除能力與總還原力較高[19-20]。與LIN等[12,27]的研究結果相比,CVPs-III的ABTS陽離子自由基清除能力與川明參非淀粉多糖和川明參葉多糖的ABTS陽離子自由基清除能力較為接近。綜上,經分離純化后得到的CVPs-III具有較好的體外抗氧化活性。

圖6 川明參多糖的抗氧化活性Fig.6 The antioxidant activity of C.violaceum polysaccharides

3 結論

本文通過水提醇沉法提取川明參粗多糖,并對經凝膠柱層析后的主要成分(CVPs-III)的結構和抗氧化活性進行分析。其結果表明,CVPs-III是一種分子質量為176 kDa,以→4)-D-Glcp-(1→4)-α-Glcp-(1→為主鏈,并含有少量→4)-α-Glcp-(1→3)-β-Glcp-(1→4)-α-Glcp-(1→的葡聚糖。此外,體外抗氧化實驗表明,CVPs-III具有較好的抗氧化活性,其次為CVPs、CVPs-II和CVPs-I。其主要組分(CVPs-III)的ABTS陽離子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、Fe2+螯合能力和·OH清除能力的IC50分別為(1.392±0.006)、(0.596±0.017)、(0.554±0.001 1)、(0.618±0.018)mg/mL。綜上,川明參多糖具有較好的抗氧化活性,可作為天然抗氧化劑的來源之一。