QuEChERS結合UHPLC-MS/MS法測定畜肉中阿苯達唑及其代謝物的殘留量

黃永橋,楊昌彪,馬凱*,毛敏霞,簡銀池

1(貴州省檢測技術研究應用中心,貴州 貴陽,550016) 2(貴州省分析測試研究院,貴州 貴陽,550016)

阿苯達唑又名丙硫咪唑,是苯并咪唑類驅蟲藥物,因其治療效果好、毒性小等優勢,被廣泛用于治療動物的腸道寄生蟲感染病,是目前獸醫臨床使用最廣泛的藥物之一[1-2]。阿苯達唑進入動物體內后會快速代謝為阿苯達唑亞砜,阿苯達唑亞砜進一步轉化為阿苯達唑砜和阿苯達唑-2-氨基砜[3-4]。目前,對養殖中使用阿苯達唑藥物的管理日益加強,對其及其代謝物進行風險評估也極為重視,是動物源性食品中獸藥殘留重點監控對象之一,GB 31650—2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》規定了其在動物性食品中的最大殘留量[5],動物肌肉中最大殘留限量為100 μg/kg。

阿苯達唑及其代謝物常用檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)[6-9]，高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[10-13]，超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用[14]，氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)[15]等。其中HPLC-MS/MS法因其準確度和靈敏度高、選擇性強等優點,廣泛用于動物源性食品中獸藥殘留的分析測定。QuEChERS凈化方法前處理簡單快速、溶劑使用量少,在農獸藥殘留分析中應用廣泛[16-19]。本研究擬利用QuEChERS技術結合超高效液相色譜-串聯質譜法(ultra high performance liquid chromatography-tandem mass-spectrometry, UHPLC-MS/MS)分析技術,通過優化色譜和質譜參數、提取溶劑和凈化方法等條件,建立了畜肉(豬肉、牛肉)中阿苯達唑及其代謝物殘留量的快速分析方法。本方法具有簡單、快速、準確和靈敏度高等優點,適用于畜肉(豬肉、牛肉)中阿苯達唑及其代謝物殘留量的快速篩查和定量分析,具有較強的實用價值。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 主要儀器

Agilent 6470三重四級桿串聯質譜儀,配有ESI源及Agilent 1290超高效液相色譜,美國Agilent公司;Blixer3攪拌機,法國ROBOT COUPA公司;UMV-2多管渦旋混合器,北京普立泰科儀器有限公司;XW-80A渦旋混合器,上海米青科實業有限公司;陶瓷均質子,迪馬科技有限公司;十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine,PSA)、0.22 μm聚四氟乙烯(poly tetra fluoroethylene,PTFE)濾膜,上海安普實驗科技股份有限公司。

1.1.2 主要試劑

甲醇、乙腈(色譜純),德國Merck公司;乙酸乙酯(分析純)、無水硫酸鎂,天津市科密歐化學試劑有限公司;甲酸(色譜純),上海安普實驗科技股份有限公司;乙酸銨(分析純),西亞試劑;阿苯達唑、阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑-2-氨基砜(純度>98%),百靈威科技有限公司。

1.2 標準溶液配制

精密稱取阿苯達唑、阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑-2-氨基砜10 mg(精確至0.000 1 g)于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度線,混勻,分別配制成質量濃度為100 mg/L標準儲備液,-18 ℃避光保存。用甲醇將4種標準儲備液分別逐級稀釋至所需的混合標準工作液,現配現用。

1.3 色譜條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus-C18反相色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm),美國Agilent公司;流動相A:0.1%(體積分數)甲酸水溶液,B:乙腈;梯度洗脫程序:0.0～0.5 min,10% B;0.5～2.5 min,10%～90% B;2.5～3.0 min,90% B;3.0～3.1 min,90%～10% B;3.1～4.5 min,10%。流速:0.3 mL/min;柱溫40 ℃;進樣體積5.0 μL。

1.4 質譜條件

離子源:電噴霧離子源,正離子掃描;多反應監測;毛細管電壓4.0 kV;霧化器壓力40 psi;干燥氣流速10 L/min;干燥氣溫度300 ℃;鞘氣流速10 L/min;鞘氣溫度300 ℃。

1.5 樣品前處理

稱取搗碎后的組織樣品5.00 g于50 mL具塞離心管中,準確加入10 mL乙腈,加入1粒陶瓷均質子,渦旋振蕩10 min,4 500 r/min常溫離心10 min,吸取2 mL上清液于15 mL離心管中,加入500 mg無水硫酸鎂和100 mg C18吸附劑,渦旋1 min,5 000 r/min離心2 min,取上清液過0.22 μm PTFE濾膜,待測。

1.6 基質工作曲線配制

依次吸取不同體積的標準使用液加入相同取樣量的2種空白基質樣品中(牛肉、豬肉),樣品按1.5前處理方法處理后得到2種基質工作曲線,分別對2種樣品進行定量校正。基質標準工作曲線范圍分別為:阿苯達唑0.05～5.00 ng/mL,阿苯達唑砜0.10～10.00 ng/mL,阿苯達唑亞砜和阿苯達唑-2-氨基砜0.50～50.00 ng/mL。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理的優化

2.1.1 提取

選用基質豬肉、牛肉陰性樣品,實驗分別考察了乙腈、含0.1%(體積分數)甲酸的乙腈溶液、乙酸乙酯和含0.1%(體積分數)甲酸的乙酸乙酯溶液的提取效率。結果見圖1-a,結果表明,2種畜肉基質中乙腈和含0.1%甲酸的乙腈溶液的提取效果明顯優于乙酸乙酯和含0.1%甲酸的乙酸乙酯溶液的提取效果,且乙腈的提取效果略優于含0.1%甲酸的乙腈溶液,因此本實驗選擇乙腈作為樣品提取溶劑。

實驗對渦旋振蕩提取的時間(5、10、15 min)進行了考察,結果發現,在5～10 min時,隨著時間的延長目標物提取效果明顯增大,10 min以后隨著時間的增加,目標物提取效果基本趨于穩定,如圖1-b所示。故實驗選用渦旋振蕩10 min作為樣品提取的時間。

a-溶劑;b-時間1-阿苯達唑；2-阿苯達唑砜；3-阿苯達唑亞砜；4-阿苯達唑-2-氨基砜圖1 提取溶劑和提取時間對豬肉、牛肉中阿苯達唑及其代謝物的回收率范圍(n=3)Fig.1 Recovery rates of albendazole and its metabolites in pork and beef with extraction solvents and extraction times

2.1.2 凈化

目前,除了市售已有的產品,常用的吸附劑有C18、PSA等。本研究擬對QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管、Oasis PRiME HLB固相萃取小柱(無須活化、上樣直接收集濾液)、PSA吸附劑及C18吸附劑凈化效果進行了考察。結果如圖2-a,使用QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管和Oasis PRiME HLB固相萃取小柱凈化時,目標物幾乎被填料完全吸附;使用PSA吸附劑時對目標物有較強的吸附作用,導致目標物損失較大;使用C18吸附劑凈化時,目標物損失較少,滿足相關要求。實驗進一步對C18吸附劑的用量(50、100、150 mg)進行優化。結果見圖2-b,使用100 mg C18吸附劑凈化樣品時,凈化效果較好,且目標物損失較少。最終本實驗使用500 mg無水硫酸鎂和100 mg C18吸附劑作為樣品前處理方法。

a-凈化試劑;b-C18用量圖2 凈化試劑及C18用量的優化(n=3)Fig.2 Optimization of purification reagent and dosage of C18

2.2 色譜條件的優化

本實驗采用超高效液相色譜配合C18超高壓反相色譜柱對目標物進行分離。實驗分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水(含2 mmol/L乙酸銨溶液)、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水(含2 mmol/L乙酸銨溶液)等不同洗脫體系對目標物分離能力。結果表明,使用乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時,目標物有良好的色譜分離效果,色譜峰峰型更好,且有較好的響應值,進一步對梯度洗脫程序進行優化,使目標物有較好的分離,縮短樣品分析時間,提高了分析效率;實驗考察了不同柱溫(25、30、40、50 ℃)對目標物分離效果的影響,結果表明采用40 ℃的柱溫時目標物有較好的分離效果。從而確立了最佳色譜條件,樣品單次分析時間僅需4.5 min,滿足大批樣品的快速檢測分析。

2.3 質譜條件的優化

配制100 μg/L的標準溶液采用不接色譜柱直接進入質譜的電噴霧離子源,在正離子模式下一級全掃描質譜得到各目標物分子離子峰([M+H]+),通過優化去簇電壓,對母離子進行二級質譜分析,得到特征碎片離子質譜圖,選擇特征碎片離子中響應值高、基線噪聲低的離子對作為定性離子對,選擇響應值最高的離子對作為定量離子對,優化子離子對碰撞能量,使其豐度最大;進一步優化毛細管電壓、霧化器壓力、干燥和鞘氣的溫度及壓力等質譜參數,使其離子化效率最佳,得到最優的質譜條件,如表1。

表1 質譜參數Table 1 Mass spectrum conditions of albendazole and its metabolites

2.4 方法學評價

2.4.1 基質效應的評價及消除

基質效應(matrix effect,ME)是與目標物共同洗脫并干擾質譜儀電離過程的基質物質引起而導致目標化合物信號強度有不同程度的增強或減弱的現象,包括基質增強效應和基質抑制效應[20],易影響儀器的靈敏度和分析結果的準確性。因而在建立UHPLC-MS/MS檢測方法時應對基質效應進行評價,為保證結果的準確可靠,采取措施消除或減弱其影響是非常必要的。本方法采用空白樣品處理液匹配標準曲線和純溶劑匹配標準曲線評價基質效應,即ME=(基質標準溶液曲線斜率/無基質標準溶液曲線斜率-1)×100%,負值表示存在基質抑制效應,正值表示存在基質增強效應,絕對值越大則基質效應越強。本文在阿苯達唑及其代謝物標準曲線范圍濃度內進行評價(表2),可以看出阿苯達唑及其代謝物均存在較強的基質效應,阿苯達唑和阿苯達唑-2-氨基砜為基質抑制效應,阿苯達唑砜和阿苯達唑亞砜為基質增強效應。

2.4.2 方法的標準曲線和檢出限

本方法采用空白樣液稀釋混合標準工作曲線,制備成系列不同濃度的混合標準工作液,在選定的色譜和質譜條件下測定,以標準溶液定量離子對峰面積(y)對其質量濃度(x)做標準曲線,得到阿苯達唑及其代謝物的工作曲線。結果表明,阿苯達唑及其代謝物各自的質量濃度范圍內,呈現良好的線性關系,相關系數(R2)均>0.998,適用于定量分析。通過向陰性樣品中添加目標物來考察方法的檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10),最終確定方法的檢出限為(μg/kg):阿苯達唑-2-氨基砜1 ;阿苯達唑亞砜1;阿苯達唑砜0.2;阿苯達唑0.1。定量限為(μg/kg):阿苯達唑-2-氨基砜3;阿苯達唑亞砜3;阿苯達唑砜0.6;阿苯達唑0.3。結果見表2,說明該方法具有較好的靈敏度。

表2 方法線性方程、相關系數、基質效應、檢出限及定量限Table 2 Calibration equation,correlation coefficient,ME,LOD and LOQ of the method

2.5 加標回收及精密度考察

選取豬肉和牛肉陰性樣品,分別添加檢出限的1、2、10倍3個不同濃度,每個添加水平做6個平行,按照1.5中的樣品前處理方法進行提取凈化,3個加標濃度連續做3 d,分別計算平均回收率和精密度,精密度以相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)表示。結果如表3所示,3個添加水平的準確度均<15%,日內(n=6)平均回收率分別為豬肉:81.9%～109.8%,牛肉:82.3%～103.5%;日內(n=6)RSD分別為豬肉:3.3%～12.5%,牛肉:1.8%～9.0%。日間(n=3)平均回收率分別為豬肉:81.8%～99.0%,牛肉:86.3%～99.0%;日間(n=3)RSD分別為豬肉:3.1%～12.6%,牛肉:2.4%～14.4%。說明該方法具有較好的重復性與準確性,能夠滿足豬肉和牛肉中阿苯達唑及其代謝物殘留量的測定。圖3為混合標準溶液、空白樣品和加標樣品的總離子流圖。

2.6 實際樣品的測定

利用本研究建立的方法對市售的50批次豬肉樣品、38批次牛肉樣品進行測定,其中1份豬肉樣品和1份牛肉樣品中阿苯達唑-2-氨基砜檢測結果為陽性,含量分別為3.40、32.1 μg/kg,其余樣品均未檢出或低于定量限。

表3 回收率和精密度Table 3 Recoveries and precision of the method

a-4種阿苯達唑混合標準溶液(阿苯達唑0.5 μg/L,阿苯達唑砜1 μg/L,阿苯達唑亞砜和阿苯達唑-2-氨基砜5 μg/L);b-豬肉樣品加標(阿苯達唑1 μg/kg,阿苯達唑砜2 μg/kg,阿苯達唑亞砜和阿苯達唑-2-氨基砜10 μg/kg);c-牛肉樣品加標(阿苯達唑1 μg/kg,阿苯達唑砜2 μg/kg,阿苯達唑亞砜和阿苯達唑-2-氨基砜10 μg/kg);d-豬肉空白樣品;e-牛肉空白樣品;A-阿苯達唑-2-氨基砜;B-阿苯達唑亞砜;C-阿苯達唑砜;D-阿苯達唑圖3 混合標準溶液、豬肉樣品加標、豬肉、牛肉樣品加標和牛肉總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of standard solution,pork sample spiked with albendazole and its metabolites,pork blank sample,beef sample spiked with albendazole and its metabolites and beef blank sample

3 結論

本研究采用高效液相色譜-串聯質譜儀建立了豬肉、牛肉中阿苯達唑及其代謝物(阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑-2-氨基砜)殘留量的快速分析方法,通過對樣品前處理、液相色譜、質譜等條件進行了優化,并進行了方法學考察。結果表明,阿苯達唑及其代謝物在4.5 min內完成分析,且目標物有較好的分離度,相關系數(R2)均>0.998,檢測限為0.1～1 μg/kg,定量限在0.3～3 μg/kg,日內(n=6)平均回收率在81.9%～109.8%,日間(n=3)平均回收率在81.8%～99.0%,精密度為1.8%～14.4%。本方法操作簡單、快速、準確、靈敏度高,重現性好,回收率高且穩定,檢測限及定量限低于現有檢測方法要求,能夠準確定性和定量分析畜肉(豬肉、牛肉)中阿苯達唑及其代謝物殘留量,滿足日常分析檢測的要求。