直接光度法和酸度控制光度法相結合測定碳酸飲料中的共存色素

江虹,龐向東

(長江師范學院 化學化工學院,重慶,408100)

飲料生產企業在生產過程中常加入食品合成色素,以提升消費者的食欲和購買欲。但合成色素食用過多,會對人體造成危害。GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑-使用標準》對食品中加入合成色素的使用量作了嚴格規定,如碳酸飲料中的藍色染料亮藍不得超過0.025 g/kg、糖果中亮藍不得超過0.30 g/kg,飲料和糖果中的黃色染料檸檬黃和日落黃均不得超過0.10 g/kg。故研究食品中合成色素的含量有著重要意義。目前,國內外對食品中合成色素的檢測方法主要有:高效液相色譜法[1-4]、液-質聯用法[5-6]、熒光法[7-9]、電化學法[10-12]和分光光度法[13-15]等。前2種方法前處理相當麻煩、費時,且運行成本較高;熒光法和電化學法的條件要求均較苛刻;分光光度法雖然操作簡便,儀器價廉,但對食品復雜成分中色素,尤其是各色素吸收峰重疊較大時,不便進行分析,需采用某些吸附和分離措施才能進行檢測,使操作變得非常復雜;文獻所報道的分光光度法除采用吸附、分離措施外,還用較復雜的數學公式來處理混合色素的含量分析問題。本文根據被測物的定性分析結果,采用直接光度法和酸度控制光度法相結合的方法,來實現碳酸飲料中混合色素的定量分析,尚未見文獻報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準物質:亮藍(bright blue,BRIB;純度≥98%,Lot:YO1030 JA13)、檸檬黃(tartrazine,TAR;純度≥98%,Lot:A3 J6L1)、日落黃(sunset yellow,SUN;純度≥98%,Lot:JN1103RA14),北京盛世康普化工技術研究院,北京普析科技有限公司。

試劑:燦爛綠(bright green,BRIG;純度99%),成都市科龍化工試劑廠;氨丁三醇(Tris,純度99%),河南天孚化工有限公司;鹽酸、氨水(NH3·H2O)、甲酸、無水乙醇,均為分析純,重慶川東化工有限公司;聚酰胺粉(純度99%),化夏化學北京公司;檸檬酸(分析純)、甲醇(分析純),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;水,自制超純水。

樣品:芬達蘋果味飲料(1#)、芬達橙味飲料(2#)、佳得樂藍莓味飲料(3#),當地超市。

1.2 儀器與設備

KQ-200VDE型超聲波清洗機,昆山市超聲儀器有限公司;U—3010型紫外-可見分光光度計,日本日立公司;pHS-3C型酸度計,上海虹益儀器儀表有限公司生產。

1.3 溶液配制

標準溶液:1.00×10-3mol/L BRIB(854.0 mg/L)、TAR(534.4 mg/L)和SUN(452.4 mg/L)貯備液,操作液均為1.00×10-4mol/L,于冰箱4 ℃保存。BRIG 溶液:1.00×10-3mol/L水溶液。Tris-HCl溶液:pH 3.0～9.8(用pH 計測定)。

1.4 樣品處理

分別準確移取1#～3# 飲料30.0 mL,置于各小燒杯中稱量(精確至±0.000 1 g),于45 ℃超聲20 min(除CO2),再用NH3·H2O調至近中性,加熱至60 ℃,往樣液中加入1 g已調成糊狀的聚酰胺粉,攪拌、抽濾,用60 ℃ pH 4.0的水(用檸檬酸調成pH 4.0)洗滌3～5 次(每次5 mL),再用甲醇-甲酸(體積比6∶4)混合液洗滌3～5次(每次5 mL),最后用水洗至洗出液為無色為止。用乙醇-氨水-水混合液(體積比7∶2∶1)解吸3～5次(每次5 mL),直至色素完全解吸,合并解吸液,加乙酸中和至近中性,再在70 ℃水浴上蒸發至近干,加水溶解后定容至5.0 mL。取該液4.0 mL,用水定容至25.0 mL,得1#～3#待測液,冰箱4 ℃保存。

1.5 實驗方法

取1.4的待測液掃描吸收光譜,定性分析各樣液中所含物質的成份,再進行各物質的定量分析。準確移取適量1.00×10-4mol/L BRIB標準溶液于10 mL比色管中,用水稀釋至刻度,搖勻。再準確移取適量1.00×10-4mol/L TAR和SUN標準溶液,分別置于10 mL比色管中,加入2.00 mL 1.00×10-3mol/L BRIG和1.00 mL Tris-HCl溶液(pH 3.50),搖勻,用水定容。待充分反應15 min后,在分光光度計上以水作參比,在628 nm處測定BRIB溶液的吸光度(A1);以相應的試劑空白作參比,在426 nm處測定TAR-BRIG 體系的吸光度(A2),在500 nm處測定SUN-BRIG體系的吸光度(A3)。從而求得飲料中共存色素—BRIB、TAR和SUN的含量。

2 結果與分析

2.1 亮藍、檸檬黃、日落黃及與燦爛綠反應的吸收光譜特征

亮藍、檸檬黃、日落黃及經1.4處理后的待測飲料樣液的吸收光譜圖見圖1。亮藍標準溶液在628 nm處有最大吸收(曲線1),檸檬黃標準溶液在428 nm有最大吸收(曲線2),日落黃標準溶液在480 nm處有最大吸收(曲線3);比較1#樣～3#樣的吸收曲線,可定性:1#樣中含有亮藍和檸檬黃(曲線4),2#樣中含有日落黃和檸檬黃(曲線5),3#樣中含有亮藍(曲線6)。

1-8.54 mg/L亮藍,水作參比;2-5.34 mg/L檸檬黃,水作參比;3-4.52 mg/L日落黃,水作參比;4-1#飲料樣液;5-2#飲料樣液;6-3#飲料樣液圖1 亮藍、檸檬黃、日落黃及飲料樣液的吸收光譜Fig.1 The absorption spectra of bright blue,tartrazine,sunset yellow and beverage samples

由圖2-a可知,當亮藍、檸檬黃和日落黃共存時,在628 nm處,可直接測定亮藍的吸光度,檸檬黃和日落黃不干擾測定;而檸檬黃和日落黃的吸收曲線相互重疊較多,干擾較大,不能進行分別定量測定。

由圖2-b可知,當以燦爛綠作探針,在pH 3.50 Tris-HCl條件下,檸檬黃與燦爛綠反應生成的離子締合物的最大吸收波長位于426 nm(燦爛綠的最大吸收波長為623 nm),相比燦爛綠紫移197 nm,說明檸檬黃與燦爛綠確實發生了化學反應生成了新的物質;日落黃與燦爛綠反應生成的離子締合物的最大吸收波長位于500 nm,相比燦爛綠藍移123 nm,說明兩者確實發生了化學反應生成了新物質。從吸收曲線2和曲線3可知,亮藍、檸檬黃和日落黃共存時,可以在426 nm處測定檸檬黃,日落黃和亮藍不干擾測定,也可在500 nm處測定日落黃,檸檬黃和亮藍也不干擾測定。

由圖3可知,亮藍、檸檬黃和日落黃在各自相應條件下,均有線性吸收關系。故當亮藍、檸檬黃和日落黃共存時,可用分光光度法直接測定亮藍,用酸度控制(pH 3.5 Tris-HCl溶液)分光光度法分別測定共存物中的檸檬黃和日落黃,從而達到分別測定共存色素含量的目的。吸收光譜特征見表1。

2.2 溶液pH

從2.1分析可知,當亮藍、檸檬黃和日落黃共存時,檸檬黃和日落黃不干擾亮藍的測定,即亮藍不需輔助條件便可直接進行定量測定,當考察Tris-HCl酸度對亮藍吸光度的影響時,結果表明,亮藍基本不受酸度的影響,這與它的耐酸、耐堿性一致,故實驗中不用調節酸度;亮藍對檸檬黃和日落黃的測定基本不干擾,當以燦爛綠作探針時,亮藍也不干擾檸檬黃和日落黃的測定;檸檬黃與日落黃測定中的干擾主要為兩種物質的互相干擾,因此本實驗考察了分別測定共存物中檸檬黃和日落黃時所需的酸度條件。從圖4-a可知,檸檬黃-燦爛綠體系與日落黃-燦爛綠體系在426 nm波長和pH 3.50 Tris-HCl條件下,可以單獨測定檸檬黃,日落黃不干擾;從圖4-b可知,檸檬黃-燦爛綠體系與日落黃-燦爛綠體系在500 nm波長和pH 3.50 Tris-HCl條件下,可以單獨測定日落黃,檸檬黃不干擾。故在2.00 mL 1.00×10-3mol/L燦爛綠條件下,選擇1.00 mL Tris-HCl (pH 3.50) 分別作為測定檸檬黃和日落黃的介質條件,從而達到分別測定共存物質的目的。

a-426 nm的吸光度值;b-500 nm的吸光度值1-5.34 mg/L檸檬黃-2.00×10-4 mol/L燦爛綠;2-4.52 mg/L日落黃-2.00×10-4 mol/L燦爛綠圖4 溶液pH對吸光度 的影響Fig.4 Effect of solution pH on absorbance

2.3 反應時間

在前述條件不變的情況下,對亮藍、檸檬黃和日落黃測定中是否受時間影響進行了考察。結果表明,單獨的亮藍測定不受時間影響;檸檬黃-燦爛綠體系與日落黃-燦爛綠體系受時間影響較大,只有在充分反應15 min后至60 min進行測定,吸光度才最大且穩定。故測定時間選在最佳時間段。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線及靈敏度

準確移取1.00×10-4mol/L亮藍和日落黃標準液0.00、0.20、0.60、1.00、1.40、1.80 mL,檸檬黃標準溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL,分別置于10 mL比色管中,并于檸檬黃和日落黃的比色管中加入1.00 mL Tris-HCl溶液(pH 3.50)和2.00 mL 1.00×10-3mol/L燦爛綠溶液,用水定容,搖勻,按1.5中的測定方法測定各標準系列溶液的吸光度(n=3),作吸光度和質量濃度的標準曲線,其相關參數見表2。可見,該方法有較寬的線性范圍、較好的線性關系和較高的靈敏度。

表2 亮藍、檸檬黃及日落黃的標準曲線相關參數Table 2 Related parameters of standard curves of bright blue,tartrazine and sunset yellow

2.4.2 方法的選擇性

按照1.5 的方法,考察某些可能的共存物質對該方法測定亮藍、檸檬黃和日落黃的影響,結果見表3。可知,當相對誤差<±5%時,用本方法測定亮藍、檸檬黃及日落黃時,氨基酸類、糖類及食品中常見的部分添加劑均有較大允許倍數,常見陰、陽離子中除Fe3+和Al3+的允許倍數較小外,其余離子有較大允許倍數,不干擾亮藍、檸檬黃及日落黃的測定。故該法有良好的選擇性。

表3 共存物質的影響Table 3 Effect of coexistent substance

2.4.3 樣品測定、準確度及精密度

取1.4下制備好的待測液2.00 mL代替標準溶液,按實驗方法測定各樣液中亮藍、檸檬黃和日落黃的含量(n=5)。再照樣液的制備方法制取樣加標(不同濃度水平)溶液,做加標回收試驗(n=5)。同時,用GB 5009.35—2016《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》中HPLC法作對照試驗,并對2種方法的測定結果進行顯著性檢驗,結果見表4。F檢驗結果表明,當置信度為90%,2種方法的測定次數均為5(自由度為4)時,2種方法測定結果的精密度間無顯著性差異;t檢驗結果表明,2種方法的準確度間無顯著性差異。故新方法準確可靠,可用于定量測定碳酸飲料中共存的亮藍、檸檬黃及日落黃的含量。

表4 飲料樣品分析結果及回收試驗(n=5)Table 4 Analysis results and recovery test of beverage samples (n=5)

3 結論

用直接光度法測定共存色素(亮藍、檸檬黃和日落黃)中的亮藍、用酸度控制光度法分別測定共存物中的檸檬黃和日落黃,有較寬的線性范圍、較高靈敏度和較好的選擇性,準確度和精密度均滿足定量分析要求。樣品處理中,色素經吸附、洗脫處理后,可以不經分離便可達到分別測定共存色素的目的。該法與液相色譜法相比,更為簡便、快速。該法適于芬達蘋果味、橙味及佳得樂藍莓味飲料中共存亮藍、檸檬黃和日落黃的批量測定。