高通量篩選高產(chǎn)維生素B12的誘變菌株
——黏著劍菌

肖志強(qiáng),朱永明,李江華,周景文,3*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122) 3(江南大學(xué) 未來(lái)食品科學(xué)中心,江蘇 無(wú)錫,214122) 4(湖南鴻鷹生物科技有限公司,湖南 津市,415400)

維生素B12化學(xué)合成極其繁瑣且昂貴,從肝臟等動(dòng)物組織提取的效率和效益十分低下。目前主要通過(guò)微生物發(fā)酵法來(lái)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)[6]。生物合成主要有2種常用工藝,一種是利用脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)或黏著劍菌(Ensiferadhaerens)進(jìn)行的有氧發(fā)酵工藝[7];一種是利用費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenrechii)進(jìn)行的厭氧發(fā)酵工藝[8]。E.adhaerens屬于根瘤菌的一種[9],發(fā)酵工藝簡(jiǎn)便,且含有生成維生素B12所需的全部基因[10],目前是主要工業(yè)生產(chǎn)菌株。維生素B12的從頭合成途徑涉及30多個(gè)基因,但是部分基因的作用機(jī)理尚不清楚[11],且大部分基因受到維生素B12的反饋調(diào)節(jié)[12]。目前,E.adhaerens的基因操作系統(tǒng)尚不完善[13]。由于上述各種原因,對(duì)于維生素B12途徑的優(yōu)化困難重重,因此本研究通過(guò)誘變育種的方式提高E.adhaerens生產(chǎn)維生素B12的能力。

相比其他傳統(tǒng)誘變方法,常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變方法具有操作簡(jiǎn)單、運(yùn)行成本低廉、條件溫和無(wú)污染無(wú)危害等優(yōu)點(diǎn),是目前最常用的誘變方法[14]。高通量篩選技術(shù)結(jié)合誘變育種仍然是目前獲得優(yōu)良突變株的主要方法。高通量篩選以各種微孔板如48、96深/淺孔板作為主要工具,利用自動(dòng)化檢測(cè)工具可快速的獲得所需的數(shù)據(jù)[15]。利用全自動(dòng)移液工作站、微生物篩選系統(tǒng)、酶標(biāo)儀等設(shè)備可以增加篩選效率[16]。另外,流式細(xì)胞儀能夠準(zhǔn)確、快速地從大量的細(xì)胞中分選出單個(gè)的目標(biāo)細(xì)胞,效率更高[17]。基于特定的熒光染色劑能夠區(qū)分細(xì)胞的死活,結(jié)合流式細(xì)胞儀可以快速地分選出通過(guò)誘變后的活細(xì)胞,節(jié)省了普通篩選流程中的平板單菌落過(guò)程[18]。通過(guò)染色劑結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)可以快速檢測(cè)誘變后的致死率[19]。基于維生素B12在361 nm處有吸收峰且干擾較少,本研究構(gòu)建了基于酶標(biāo)儀的維生素B12檢測(cè)系統(tǒng)[20]。以1株維生素B12工業(yè)生產(chǎn)菌株黏著劍菌(E.adhaerens)作為出發(fā)菌株,通過(guò)ARTP誘變處理,結(jié)合流式細(xì)胞儀、移液工作站、酶標(biāo)儀、微孔板等儀器設(shè)備對(duì)誘變后的菌株進(jìn)行檢測(cè)、分選和培養(yǎng)[21],對(duì)高產(chǎn)菌株進(jìn)行初篩,隨后通過(guò)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,HPLC檢測(cè)獲得穩(wěn)定高產(chǎn)維生素B12菌株。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

黏著劍菌(Ensiferadhaerens),湖南鴻鷹生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 10,酵母粉 5,NaCl 10 (固體加瓊脂 15)。

種子培養(yǎng)基(g/L):甜菜糖蜜 100,(NH4)2SO40.7,MnSO40.02,ZnSO4·7H2O 0.02,MgSO4·7H2O 1.5,(NH4)2HPO41.8,CoCl20.02,5,6-二甲基苯并咪唑(DMBI) 0.01,乳化硅油 0.2 (pH 7.3～7.4)。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):麥芽糖漿 100,甜菜堿 15,KH2PO41.0,ZnSO4·7H2O 0.1,CoCl20.084,DMBI 0.07,FeCl30.83,甘油磷酸脂 0.18,玉米漿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%) 50,輕質(zhì)MgCl20.05,MgSO41.3,(NH4)2SO41.3,尿素 0.63,輕質(zhì)CaCO31.0 (pH 7.5～7.8)。

1.1.3 試劑與儀器

氰鈷胺,麥克林公司;羥鈷胺,Sigma公司;NaNO2、冰醋酸,國(guó)藥集團(tuán)公司。

ARTP-IIS型 ARTP 誘變育種儀,無(wú)錫源清天木生物科技有限公司;Cytation3酶標(biāo)儀,美國(guó) BioTek 公司;LC-20AT高效液相色譜,日本島津公司;FACSAriaIII流式細(xì)胞儀,美國(guó)BD 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

平板活化:從甘油管或斜面上挑取1環(huán)菌體于LB固體平板上劃線,30 ℃培養(yǎng)3 d至長(zhǎng)出單菌落。

搖瓶培養(yǎng):從平板上挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基中,30 ℃、220 r/min培養(yǎng)48 h長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):以體積分?jǐn)?shù)為10%的接種量,從培養(yǎng)了48 h的液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃、220 r/min發(fā)酵180 h。

1.2.2 ARTP誘變方法

出發(fā)菌株黏著劍菌(E.adhaerens)在LB液體培養(yǎng)基中,30 ℃,220 r/min條件下培養(yǎng)24 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期。吸取1 mL菌液至1.5 mL無(wú)菌EP管中,離心取上清液,用無(wú)菌PBS (pH=7.4)或生理鹽水洗菌體3次,用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%甘油的無(wú)菌PBS或生理鹽水稀釋至OD600為0.6～0.8。吸取10 μL稀釋后的菌液均勻的涂于ARTP誘變用的無(wú)菌載片表面,用ARTP誘變儀對(duì)進(jìn)行誘變。樣品處理完畢后,將載片放入無(wú)菌PBS或生理鹽水中,振蕩30～60 s,洗脫載片上的誘變菌液形成新的菌懸液。將新的菌懸液稀釋梯度涂布于LB固體平板上,30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后計(jì)數(shù)。

1.2.3 誘變致死率計(jì)算方法

致死率按公式(1)計(jì)算

(1)

式中:A,在同一稀釋梯度下未經(jīng)ARTP處理的空白對(duì)照平板單菌落個(gè)數(shù);B,經(jīng)過(guò)誘變處理后的平板單菌落個(gè)數(shù)。

1.2.4 基于流式細(xì)胞儀的高通量篩選方法

染料的配制與染色:稱取1 mg熒光染料碘化丙啶(propidium iodide,PI),用PBS(pH=7.4)緩沖液定量至10 mL,獲得100 μg/mL的PI母液,4 ℃避光保存?zhèn)溆谩Ｈ≌T變后的菌液950 μL,加50 μL 100 μg/mL的PI母液,4 ℃避光染色20 min。

將染色后的菌液通過(guò)流式細(xì)胞儀分選至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的48深孔板,30 ℃,220 r/min發(fā)酵180 h,按照1.3.2的方法進(jìn)行鈷胺素的檢測(cè),將獲得的高產(chǎn)菌株劃線活化后進(jìn)行搖瓶的復(fù)篩。

1.3 鈷胺素檢測(cè)方法

1.3.1 基于高效液相色譜(HPLC)的檢測(cè)方法

取400 μL發(fā)酵液于1.5 mL EP管中,加入40 μL冰醋酸和40 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%的NaNO2,搖勻,煮沸30 min。待冷卻至室溫后加入520 μL水,離心吸取上清液500 μL至新的1.5 mL EP管中,加入200 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.55%的KH2PO4,加入200 μL的水,混勻后過(guò)0.22 μm濾膜進(jìn)行液相檢測(cè)。

HPLC檢測(cè)條件:C18-250A色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)=28∶72。等速洗脫,洗脫流速為0.8 mL/min,吸收波長(zhǎng)為361 nm,色譜柱溫為38 ℃,進(jìn)樣體積10 μL。

1.3.2 基于酶標(biāo)儀的檢測(cè)方法

由于鈷胺素在361 nm處有吸收峰,取發(fā)酵后孔板中的發(fā)酵液100 μL于96淺孔板中,加入100 μL 0.4 mol/L的草酸,靜置破壁20 min,離心取上清液稀釋20倍,通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔液體在361 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素B12篩選方法的建立

2.1.1 鈷胺素標(biāo)準(zhǔn)品與OD361的相關(guān)性

鈷胺素標(biāo)準(zhǔn)品的水溶液通過(guò)光譜掃描,發(fā)現(xiàn)鈷胺素在361 nm處有最大吸收峰。將鈷胺素水溶液稀釋至一定濃度梯度,檢測(cè)其在361 nm處的吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,鈷胺素水溶液與OD361具有良好的相關(guān)性(R2=0.999 59),其線性化方程為Y=8.677 82X+0.081 49。再將鈷胺素標(biāo)準(zhǔn)品用發(fā)酵培養(yǎng)基配成一定濃度梯度鈷胺素溶液,檢測(cè)其在361 nm處的吸光值,繪制曲線檢測(cè)發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)鈷胺素的干擾,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)鈷胺素的吸光度干擾不大(R2=0.971 6),其線性化方程為Y=0.502 64X+0.587 53。因此,該方法可以作為鈷胺素產(chǎn)量的初篩檢測(cè)方法。

2.1.2 草酸破壁時(shí)間的確定

由于E.adhaerens所產(chǎn)生的鈷胺素會(huì)有大部分分泌至胞外,因此用于高通量篩選需要有一個(gè)方便且快速的破壁方法,以快速檢測(cè)發(fā)酵液中所有鈷胺素的產(chǎn)量。本研究采用0.4 mol/L的草酸作為細(xì)胞破壁試劑,取180 h發(fā)酵液500 μL,加入500 μL的0.4 mol/L的草酸(對(duì)照加等量的水),分別反應(yīng)5、10、15、20 min,通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞破碎情況,結(jié)果如圖1所示。處理細(xì)胞到10 min時(shí),細(xì)胞基本破碎完全,考慮到細(xì)胞破碎完全問(wèn)題,后續(xù)采用破壁時(shí)間20 min。

a-未處理的發(fā)酵液;b-草酸處理5 min;c-草酸處理10 min;d-草酸處理15 min圖1 草酸破壁鏡檢圖Fig.1 Microscopic examination of cell wall broken by oxalic acid

2.1.3 初篩方法的精確性檢測(cè)

在發(fā)酵過(guò)程中的不同時(shí)間取樣,加入0.4 mol/L草酸破壁處理20 min,離心取上清液,分別用酶標(biāo)儀和HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中鈷胺素產(chǎn)量,繪制相關(guān)曲線檢驗(yàn)酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果與HPLC檢測(cè)結(jié)果之間的相關(guān)性。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè),OD361與發(fā)酵產(chǎn)量的相關(guān)性良好(R2=0.938 13),其線性化方程為Y=5.905 68X-2.118 67。因此,上述破壁及檢測(cè)方法可以作為維生素B12初篩檢測(cè)的“篩子”。

2.2 ARTP誘變致死率曲線的繪制

通過(guò)平板計(jì)數(shù)法計(jì)算ARTP致死率,將誘變后的菌懸液稀釋成不同的濃度梯度后涂布LB固體平板,30 ℃培養(yǎng)3 d,計(jì)算不同誘變時(shí)間涂板所長(zhǎng)出的菌落數(shù),計(jì)算致死率,繪制致死率曲線,結(jié)果如圖2所示。當(dāng)處理時(shí)間在80 s時(shí),致死率達(dá)到90%;當(dāng)處理時(shí)間在120 s時(shí),致死率接近100%。故選取ARTP處理時(shí)間80 s,致死率90%左右作為后續(xù)處理的條件。

圖2 ARTP誘變致死率曲線Fig.2 ARTP mutagenesis lethality curve

2.3 流式細(xì)胞儀分選結(jié)果

以未經(jīng)PI染色的菌懸液作為陰性對(duì)照,用流式細(xì)胞儀區(qū)分ARTP不同處理?xiàng)l件下活細(xì)胞與死細(xì)胞，圖3-a設(shè)門(mén)P1圈出E.adhaerens菌株區(qū)域,以防止菌液中微小顆粒的干擾;圖3-b設(shè)門(mén)P2圈出菌液中的單個(gè)細(xì)胞,以防止黏連細(xì)胞干擾;圖3-c根據(jù)陰性對(duì)照設(shè)門(mén)Q1圈出菌液中的活細(xì)胞;圖3-d PI染色后的菌液根據(jù)陰性對(duì)照區(qū)分菌液中的死細(xì)胞和活細(xì)胞。

2.4 誘變育種篩選結(jié)果

2.4.1 誘變突變菌株的初篩

借助于流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀檢測(cè)器等能夠快速、準(zhǔn)確地分析并獲得菌株,已廣泛應(yīng)用于微生物的高通量篩選[21]。本研究采用ARTP誘變菌株E.adhaerensF3-3,進(jìn)行2輪誘變。取發(fā)酵液按照1.3.2的方法進(jìn)行處理,通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)處理后液體在361 nm處的吸光度從而篩選出高產(chǎn)維生素B12的菌株,結(jié)果如圖4所示。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)361 nm處的吸光值，獲得不同生產(chǎn)能力的菌株，從中選出29株生產(chǎn)能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行后續(xù)的復(fù)篩。

a-設(shè)門(mén)P1圈出脫氮假單孢桿菌區(qū)域;b-設(shè)門(mén)P2去除菌株中的黏連細(xì)胞；c-根據(jù)陰性對(duì)照設(shè)門(mén)圈出活細(xì)胞;d-PI染色后設(shè)門(mén)區(qū)分細(xì)胞的死活圖3 PI染料染色流式圖Fig.3 Flow cytometry diagram after PI dye staining

圖4 誘變菌株初篩結(jié)果Fig.4 Preliminary screening of mutagenic strains

2.4.2 誘變突變菌株的復(fù)篩

圖5 誘變菌株復(fù)篩產(chǎn)量Fig.5 Mutagenic strain re-screening yield

將初篩得到的高產(chǎn)菌株重新劃線接種發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證,30 ℃、220 r/min培養(yǎng)180 h后,通過(guò)HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中維生素B12的產(chǎn)量,經(jīng)過(guò)2輪篩選,獲得高產(chǎn)菌株46H-1(圖5)。通過(guò)遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證后最終產(chǎn)量為110.25 mg/L(表1),產(chǎn)量相較于原始菌株F3-3(88.36 mg/L)提高了24.8%。

表1 突變菌株遺傳穩(wěn)定性分析Table 1 Analysis of genetic stability of mutant strains

3 討論與結(jié)論

由于維生素B12的生物合成途徑復(fù)雜,主要是通過(guò)誘變育種的方式強(qiáng)化生產(chǎn)。目前,有關(guān)維生素B12生產(chǎn)菌株誘變后的快速檢測(cè)方法較少,利用高效液相色譜等檢測(cè)方法過(guò)于復(fù)雜不便于快速檢測(cè);同時(shí),由于E.adhaerens所生產(chǎn)的維生素B12有一部分會(huì)殘留在胞內(nèi),因此需要有一個(gè)對(duì)于菌株快速處理破壁釋放維生素B12的方法。本研究應(yīng)用ARTP誘變對(duì)維生素B12工業(yè)生產(chǎn)菌株E.adhaerens進(jìn)行誘變處理,結(jié)合流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀以及移液工作站等儀器對(duì)誘變菌株進(jìn)行分選、檢測(cè)。由于維生素B12在361 nm處具有吸收峰,同時(shí)E.adhaerens所產(chǎn)生的維生素B12會(huì)有部分殘留在胞內(nèi),因此根據(jù)這2個(gè)特點(diǎn),構(gòu)建了對(duì)于E.adhaerens的快速高效的破壁方法以及檢測(cè)方法。通過(guò)2輪的ARTP誘變及篩選,獲得突變菌株46H-1,產(chǎn)量相較于原始菌株提升了24.8%,經(jīng)驗(yàn)證,具有較好的遺傳穩(wěn)定性。