高通量篩選高產維生素B12的誘變菌株
——黏著劍菌

肖志強,朱永明,李江華,周景文,3*

1(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 2(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 3(江南大學 未來食品科學中心,江蘇 無錫,214122) 4(湖南鴻鷹生物科技有限公司,湖南 津市,415400)

維生素B12化學合成極其繁瑣且昂貴,從肝臟等動物組織提取的效率和效益十分低下。目前主要通過微生物發酵法來實現商業化生產[6]。生物合成主要有2種常用工藝,一種是利用脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)或黏著劍菌(Ensiferadhaerens)進行的有氧發酵工藝[7];一種是利用費氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenrechii)進行的厭氧發酵工藝[8]。E.adhaerens屬于根瘤菌的一種[9],發酵工藝簡便,且含有生成維生素B12所需的全部基因[10],目前是主要工業生產菌株。維生素B12的從頭合成途徑涉及30多個基因,但是部分基因的作用機理尚不清楚[11],且大部分基因受到維生素B12的反饋調節[12]。目前,E.adhaerens的基因操作系統尚不完善[13]。由于上述各種原因,對于維生素B12途徑的優化困難重重,因此本研究通過誘變育種的方式提高E.adhaerens生產維生素B12的能力。

相比其他傳統誘變方法,常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變方法具有操作簡單、運行成本低廉、條件溫和無污染無危害等優點,是目前最常用的誘變方法[14]。高通量篩選技術結合誘變育種仍然是目前獲得優良突變株的主要方法。高通量篩選以各種微孔板如48、96深/淺孔板作為主要工具,利用自動化檢測工具可快速的獲得所需的數據[15]。利用全自動移液工作站、微生物篩選系統、酶標儀等設備可以增加篩選效率[16]。另外,流式細胞儀能夠準確、快速地從大量的細胞中分選出單個的目標細胞,效率更高[17]。基于特定的熒光染色劑能夠區分細胞的死活,結合流式細胞儀可以快速地分選出通過誘變后的活細胞,節省了普通篩選流程中的平板單菌落過程[18]。通過染色劑結合流式細胞儀檢測可以快速檢測誘變后的致死率[19]。基于維生素B12在361 nm處有吸收峰且干擾較少,本研究構建了基于酶標儀的維生素B12檢測系統[20]。以1株維生素B12工業生產菌株黏著劍菌(E.adhaerens)作為出發菌株,通過ARTP誘變處理,結合流式細胞儀、移液工作站、酶標儀、微孔板等儀器設備對誘變后的菌株進行檢測、分選和培養[21],對高產菌株進行初篩,隨后通過搖瓶發酵復篩,HPLC檢測獲得穩定高產維生素B12菌株。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

黏著劍菌(Ensiferadhaerens),湖南鴻鷹生物科技有限公司。

1.1.2 培養基

LB培養基(g/L):蛋白胨 10,酵母粉 5,NaCl 10 (固體加瓊脂 15)。

種子培養基(g/L):甜菜糖蜜 100,(NH4)2SO40.7,MnSO40.02,ZnSO4·7H2O 0.02,MgSO4·7H2O 1.5,(NH4)2HPO41.8,CoCl20.02,5,6-二甲基苯并咪唑(DMBI) 0.01,乳化硅油 0.2 (pH 7.3～7.4)。

發酵培養基(g/L):麥芽糖漿 100,甜菜堿 15,KH2PO41.0,ZnSO4·7H2O 0.1,CoCl20.084,DMBI 0.07,FeCl30.83,甘油磷酸脂 0.18,玉米漿(質量分數為50%) 50,輕質MgCl20.05,MgSO41.3,(NH4)2SO41.3,尿素 0.63,輕質CaCO31.0 (pH 7.5～7.8)。

1.1.3 試劑與儀器

氰鈷胺,麥克林公司;羥鈷胺,Sigma公司;NaNO2、冰醋酸,國藥集團公司。

ARTP-IIS型 ARTP 誘變育種儀,無錫源清天木生物科技有限公司;Cytation3酶標儀,美國 BioTek 公司;LC-20AT高效液相色譜,日本島津公司;FACSAriaIII流式細胞儀,美國BD 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養條件

平板活化:從甘油管或斜面上挑取1環菌體于LB固體平板上劃線,30 ℃培養3 d至長出單菌落。

搖瓶培養:從平板上挑取單菌落接種于種子培養基中,30 ℃、220 r/min培養48 h長至對數生長期。

搖瓶發酵培養:以體積分數為10%的接種量,從培養了48 h的液體培養基轉接于發酵培養基中,30 ℃、220 r/min發酵180 h。

1.2.2 ARTP誘變方法

出發菌株黏著劍菌(E.adhaerens)在LB液體培養基中,30 ℃,220 r/min條件下培養24 h至對數生長中后期。吸取1 mL菌液至1.5 mL無菌EP管中,離心取上清液,用無菌PBS (pH=7.4)或生理鹽水洗菌體3次,用含有質量分數為5%甘油的無菌PBS或生理鹽水稀釋至OD600為0.6～0.8。吸取10 μL稀釋后的菌液均勻的涂于ARTP誘變用的無菌載片表面,用ARTP誘變儀對進行誘變。樣品處理完畢后,將載片放入無菌PBS或生理鹽水中,振蕩30～60 s,洗脫載片上的誘變菌液形成新的菌懸液。將新的菌懸液稀釋梯度涂布于LB固體平板上,30 ℃培養箱中培養3 d后計數。

1.2.3 誘變致死率計算方法

致死率按公式(1)計算

(1)

式中:A,在同一稀釋梯度下未經ARTP處理的空白對照平板單菌落個數;B,經過誘變處理后的平板單菌落個數。

1.2.4 基于流式細胞儀的高通量篩選方法

染料的配制與染色:稱取1 mg熒光染料碘化丙啶(propidium iodide,PI),用PBS(pH=7.4)緩沖液定量至10 mL,獲得100 μg/mL的PI母液,4 ℃避光保存備用。取誘變后的菌液950 μL,加50 μL 100 μg/mL的PI母液,4 ℃避光染色20 min。

將染色后的菌液通過流式細胞儀分選至裝有發酵培養基的48深孔板,30 ℃,220 r/min發酵180 h,按照1.3.2的方法進行鈷胺素的檢測,將獲得的高產菌株劃線活化后進行搖瓶的復篩。

1.3 鈷胺素檢測方法

1.3.1 基于高效液相色譜(HPLC)的檢測方法

取400 μL發酵液于1.5 mL EP管中,加入40 μL冰醋酸和40 μL 質量分數為12.5%的NaNO2,搖勻,煮沸30 min。待冷卻至室溫后加入520 μL水,離心吸取上清液500 μL至新的1.5 mL EP管中,加入200 μL質量分數為12.55%的KH2PO4,加入200 μL的水,混勻后過0.22 μm濾膜進行液相檢測。

HPLC檢測條件:C18-250A色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為V(甲醇)∶V(水)=28∶72。等速洗脫,洗脫流速為0.8 mL/min,吸收波長為361 nm,色譜柱溫為38 ℃,進樣體積10 μL。

1.3.2 基于酶標儀的檢測方法

由于鈷胺素在361 nm處有吸收峰,取發酵后孔板中的發酵液100 μL于96淺孔板中,加入100 μL 0.4 mol/L的草酸,靜置破壁20 min,離心取上清液稀釋20倍,通過酶標儀檢測各孔液體在361 nm處的吸光度。

2 結果與分析

2.1 維生素B12篩選方法的建立

2.1.1 鈷胺素標準品與OD361的相關性

鈷胺素標準品的水溶液通過光譜掃描,發現鈷胺素在361 nm處有最大吸收峰。將鈷胺素水溶液稀釋至一定濃度梯度,檢測其在361 nm處的吸光值,繪制標準曲線,鈷胺素水溶液與OD361具有良好的相關性(R2=0.999 59),其線性化方程為Y=8.677 82X+0.081 49。再將鈷胺素標準品用發酵培養基配成一定濃度梯度鈷胺素溶液,檢測其在361 nm處的吸光值,繪制曲線檢測發酵培養基對鈷胺素的干擾,發現發酵培養基對鈷胺素的吸光度干擾不大(R2=0.971 6),其線性化方程為Y=0.502 64X+0.587 53。因此,該方法可以作為鈷胺素產量的初篩檢測方法。

2.1.2 草酸破壁時間的確定

由于E.adhaerens所產生的鈷胺素會有大部分分泌至胞外,因此用于高通量篩選需要有一個方便且快速的破壁方法,以快速檢測發酵液中所有鈷胺素的產量。本研究采用0.4 mol/L的草酸作為細胞破壁試劑,取180 h發酵液500 μL,加入500 μL的0.4 mol/L的草酸(對照加等量的水),分別反應5、10、15、20 min,通過顯微鏡觀察細胞破碎情況,結果如圖1所示。處理細胞到10 min時,細胞基本破碎完全,考慮到細胞破碎完全問題,后續采用破壁時間20 min。

a-未處理的發酵液;b-草酸處理5 min;c-草酸處理10 min;d-草酸處理15 min圖1 草酸破壁鏡檢圖Fig.1 Microscopic examination of cell wall broken by oxalic acid

2.1.3 初篩方法的精確性檢測

在發酵過程中的不同時間取樣,加入0.4 mol/L草酸破壁處理20 min,離心取上清液,分別用酶標儀和HPLC檢測發酵液中鈷胺素產量,繪制相關曲線檢驗酶標儀檢測結果與HPLC檢測結果之間的相關性。通過酶標儀檢測,OD361與發酵產量的相關性良好(R2=0.938 13),其線性化方程為Y=5.905 68X-2.118 67。因此,上述破壁及檢測方法可以作為維生素B12初篩檢測的“篩子”。

2.2 ARTP誘變致死率曲線的繪制

通過平板計數法計算ARTP致死率,將誘變后的菌懸液稀釋成不同的濃度梯度后涂布LB固體平板,30 ℃培養3 d,計算不同誘變時間涂板所長出的菌落數,計算致死率,繪制致死率曲線,結果如圖2所示。當處理時間在80 s時,致死率達到90%;當處理時間在120 s時,致死率接近100%。故選取ARTP處理時間80 s,致死率90%左右作為后續處理的條件。

圖2 ARTP誘變致死率曲線Fig.2 ARTP mutagenesis lethality curve

2.3 流式細胞儀分選結果

以未經PI染色的菌懸液作為陰性對照,用流式細胞儀區分ARTP不同處理條件下活細胞與死細胞，圖3-a設門P1圈出E.adhaerens菌株區域,以防止菌液中微小顆粒的干擾;圖3-b設門P2圈出菌液中的單個細胞,以防止黏連細胞干擾;圖3-c根據陰性對照設門Q1圈出菌液中的活細胞;圖3-d PI染色后的菌液根據陰性對照區分菌液中的死細胞和活細胞。

2.4 誘變育種篩選結果

2.4.1 誘變突變菌株的初篩

借助于流式細胞儀、酶標儀檢測器等能夠快速、準確地分析并獲得菌株,已廣泛應用于微生物的高通量篩選[21]。本研究采用ARTP誘變菌株E.adhaerensF3-3,進行2輪誘變。取發酵液按照1.3.2的方法進行處理,通過酶標儀檢測處理后液體在361 nm處的吸光度從而篩選出高產維生素B12的菌株,結果如圖4所示。通過酶標儀檢測361 nm處的吸光值，獲得不同生產能力的菌株，從中選出29株生產能力較強的菌株進行后續的復篩。

a-設門P1圈出脫氮假單孢桿菌區域;b-設門P2去除菌株中的黏連細胞；c-根據陰性對照設門圈出活細胞;d-PI染色后設門區分細胞的死活圖3 PI染料染色流式圖Fig.3 Flow cytometry diagram after PI dye staining

圖4 誘變菌株初篩結果Fig.4 Preliminary screening of mutagenic strains

2.4.2 誘變突變菌株的復篩

圖5 誘變菌株復篩產量Fig.5 Mutagenic strain re-screening yield

將初篩得到的高產菌株重新劃線接種發酵培養基進行發酵驗證,30 ℃、220 r/min培養180 h后,通過HPLC檢測發酵液中維生素B12的產量,經過2輪篩選,獲得高產菌株46H-1(圖5)。通過遺傳穩定性驗證后最終產量為110.25 mg/L(表1),產量相較于原始菌株F3-3(88.36 mg/L)提高了24.8%。

表1 突變菌株遺傳穩定性分析Table 1 Analysis of genetic stability of mutant strains

3 討論與結論

由于維生素B12的生物合成途徑復雜,主要是通過誘變育種的方式強化生產。目前,有關維生素B12生產菌株誘變后的快速檢測方法較少,利用高效液相色譜等檢測方法過于復雜不便于快速檢測;同時,由于E.adhaerens所生產的維生素B12有一部分會殘留在胞內,因此需要有一個對于菌株快速處理破壁釋放維生素B12的方法。本研究應用ARTP誘變對維生素B12工業生產菌株E.adhaerens進行誘變處理,結合流式細胞儀、酶標儀以及移液工作站等儀器對誘變菌株進行分選、檢測。由于維生素B12在361 nm處具有吸收峰,同時E.adhaerens所產生的維生素B12會有部分殘留在胞內,因此根據這2個特點,構建了對于E.adhaerens的快速高效的破壁方法以及檢測方法。通過2輪的ARTP誘變及篩選,獲得突變菌株46H-1,產量相較于原始菌株提升了24.8%,經驗證,具有較好的遺傳穩定性。