兩歧雙歧桿菌F35氮源利用的差異性解析

汪文麗,崔樹茂,唐鑫,毛丙永,趙建新,陳衛

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

雙歧桿菌作為人體腸道中非常重要的一類菌群,具有調節腸道菌群,維持腸道菌群環境平衡;增強機體免疫及改善蛋白質代謝,促進蛋白質吸收等多種生物學功能[1]。但是雙歧桿菌是一類挑剔的微生物,其生長所需的營養物質較為復雜,對氮源的需求更為苛刻。目前市面上可商業化的雙歧桿菌多為動物雙歧桿菌、短雙歧桿菌和長雙歧桿菌,兩歧雙歧桿菌較少。因為兩歧雙歧桿菌的制備非常困難,且大部分的兩歧雙歧桿菌的耐滲透壓能力弱,這就意味著氮源中不被利用的成分將通過增加發酵液的滲透壓對菌株的生長產生抑制作用,氮源能否被有效利用是制約其生長的一個關鍵因素。

為了在蛋白質豐富的環境中生長,乳酸菌在不斷進化過程中形成了蛋白水解系統來降解外源蛋白,產生多肽及游離氨基酸以滿足自身的生長需求。蛋白水解系統主要由3個部分組分[2-3]:將外源大分子蛋白水解成多肽的細胞壁蛋白酶(cell envelope protease,CEP);將多肽轉運進入細胞內的多個肽轉運系統;以及將轉運進入細胞內的多肽進一步水解成游離氨基酸的多種肽酶。雙歧桿菌的形態和生理特征與乳酸菌相似[4],但其蛋白水解系統并不完備。JANER等[5]研究發現,在動物雙歧桿菌中不含CEP活性,但是鑒定并表征出細胞壁內肽酶PepO。CHANG等[6]研究也發現在長雙歧桿菌KACC中不存在CEP,盡管在長雙歧桿菌DJO10A以及長雙歧桿菌嬰兒亞種ATCC15697中存在一種類似枯草芽孢桿菌蛋白酶的絲氨酸蛋白酶,但是對其遺傳和生化特性及鑒定仍未見報道。

雖然大部分雙歧桿菌缺乏CEP,但王靖麟等[7]發現,鱘魚肝蛋白酶解液對6株雙歧桿菌均具有顯著的促生長效果,說明經處理后得到的多肽和游離氨基酸可被菌株利用以滿足其生長需求。張娜等[8]利用堿性蛋白酶水解大豆蛋白后得到的組分能夠有效促進雙歧桿菌L80的增殖。這些現象表明,雙歧桿菌蛋白水解系統不完備,水解蛋白質的能力弱,但可以利用環境中的多肽及游離氨基酸進行生長。因此,通過不同途徑制備得到的氮源,其多肽及游離氨基酸的組成將是制約雙歧桿菌生長的關鍵因素。本文所研究的兩歧雙歧桿菌F35在前期實驗中,已從基因型和表型兩方面驗證其不存在CEP相關活性,在此基礎上,將系統探究兩歧雙歧桿菌F35對不同氮源的利用效率,并對氮源的組成特性做進一步分析,為今后氮源生產企業針對兩歧雙歧桿菌生產適宜氮源提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

兩歧雙歧桿菌F35(CCFM16),由江南大學食品生物技術中心保藏。

1.1.2 試劑

葡萄糖、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、NaCl,谷氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸等18種氨基酸,鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤、葉酸、煙酸等13種堿基維生素,國藥集團化學試劑有限公司;酵母浸粉888、酵母浸粉803、大豆蛋白胨、魚骨蛋白胨,安琪酵母有限公司;胰蛋白胨、胰酪蛋白胨,鄭州盛仁堂生物科技有限公司;魚蛋白胨、牛骨蛋白胨,上海耐今實業有限公司;含17種氨基酸的標準溶液,美國Sigma公司;三乙胺、乙腈(色譜純)、異硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate,PITC)、酪蛋白,創賽生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;UV—2450紫外分光光度計,日本島津公司;MS3 IKA振蕩器,德國IKA;Waters 1525高效液相色譜儀,美國沃特世公司;AW500SG Electrotek厭氧工作站,英國依萊泰科;Ag 1100高效液相色譜儀,美國安捷倫公司;Lyobeta 5ps凍干機,西班牙泰式達公司;電熱恒溫水浴鍋,上海森信實驗有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的活化與菌體的制備

將冷藏于-80 ℃的保菌管取出,待其融化后,用接種環蘸取少量菌液于MRS-L固體培養基上劃線,于厭氧工作站中37 ℃恒溫培養48 h。待長出菌落后,挑取單菌落接種于5 mL MRS液體管中,厭氧培養18～24 h,按上述操作重復2～3次得到活化的菌液。

參考周興雅[9]的方法,離心活化后的菌體,收集2 g以上菌泥待基因組測定。

1.3.2 兩歧雙歧桿菌利用不同氮源的增殖效果

準確稱取25 g/L的酵母浸粉888、酵母浸粉803等上述8種氮源,替換MRS培養基中的全部氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母粉),配制成不同的含單一氮源的培養基,按2%的接種量接種上述活化好的菌液,厭氧工作站中37 ℃恒溫培養至穩定期,測定OD600及pH,以MRS組為對照。

1.3.3 不同氮源組成成分分析

1.3.3.1 氮源分子質量分布的測定

采用高效液相色譜法測定分子質量的分布情況,洗脫條件:TSKgel 2000 SWXL色譜柱(300 mm×7.8 mm),流動相是V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1的混合溶液,柱溫30 ℃,流速設置為0.5 mL/min,紫外檢測器的檢測波長220 nm。

1.3.3.2 氮源中游離氨基酸組成分析

稱取1 g左右的氮源并準確記錄質量,用0.5 g/L的三氯乙酸定容至25 mL,混勻后常溫超聲20 min,靜置3 h。溶液經雙層濾紙過濾后,取1 mL澄清的濾液于離心管中,15 000 r/min離心30 min后取400 μL待測。采用反相高效液相色譜(reverse phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)測定氨基酸,進行PITC柱前衍生化[10]:取200 μL樣品溶液于1.5 mL離心管中,加入100 μL體積分數14%三乙胺乙腈溶液,100 μL 體積分數1.25% PITC乙腈溶液,混勻后室溫靜置1 h。然后加入300 μL正己烷,搖勻后放置10 min,10 000 r/min離心5 min,取下層溶液,0.45 μm針頭過濾器過濾。取20 μL上柱分析(Fortis C18,250 mm×4.6 mm),利用pH 6.5醋酸鈉溶液(流動相A)和80%乙腈溶液(流動相B)進行梯度洗脫,流速1 mL/min,柱溫43 ℃,檢測波長254 nm,上樣體積5 μL。

1.3.4 酪蛋白水解物對兩歧雙歧桿菌的促生長活性分析

1.3.4.1 酪蛋白水解物的制備

配制底物質量濃度70 g/L的酪蛋白溶液,95 ℃,10 min熱處理鈍化酶后,調整至風味蛋白酶最適反應溫度和pH,加酶量為4 000 U/g 蛋白,采用pH-stat法使體系維持在最適pH±0.05,反應結束后立即沸水浴10 min使酶失活,冷卻后將溶液pH值調整到4.6沉淀未水解的酪蛋白,8 000 r/min離心15 min后取上清液,凍干收集干粉備用。

1.3.4.2 促進兩歧雙歧桿菌生長活性的測定

將酪蛋白水解物、酪蛋白水解物與酵母浸粉888質量比1∶1的復合物,分別等氮量替換化學合成培養基(chemically defined medium,CDM)[11-12]中氮源(氨基酸),接種2%的活化菌液,于厭氧工作站中37 ℃恒溫培養至穩定期,測定發酵液pH及OD600。

1.3.5 兩歧雙歧桿菌氨基酸營養缺陷型測定

關于氨基酸營養缺陷型的測定,采用CDM對兩歧雙歧桿菌進行測定。配制18種分別缺失1種氨基酸的培養基以及1種全氨基酸培養基,接種2%的活化菌液,于厭氧工作站中37 ℃恒溫培養至穩定期,測定發酵液pH及OD600,測定菌株在各培養基中的生長情況,以全氨基酸培養基組為對照。

1.3.6 基因草圖測序及組裝

采用denovo從頭測序。菌株的掃描采用Illumina HiSeq測序平臺,對質檢合格的DNA樣品構建插入片段為400 bp的片段,進行PE150(pair-end)測序,即雙端測序,單端測序讀長150 bp,每個樣品提供不低于基因組100×覆蓋深度的原始測序數據量(raw data),最終組裝得到多條基因組scaffold。由于Illumina Hiseq的原始測序數據會存在一些質量比較低的數據,另外一般raw data中會有極少部分的reads帶有測序引物、接頭等人工列,為了使后續的組裝更加準確,測序過程中會對原始數據進行質量剪切,以得到高質量序列[13]。

利用軟件SOAPdenovo2(http://soap.genomics.org.cn/)對二代測序后的優化序列進行多個Kmer參數的拼接,得到最優的contigs組裝結果,然后把reads比對到contig上,根據reads的paired-end和overlap關系,對組裝結果進行局部組裝和優化,形成scaffolds。

1.3.7 基因組預測與注釋

利用Glimmer[14](http://ccb.jhu.edu/software/glimmer/index.shtml),GeneMarkS[15],Prodigal軟件對基因組中的編碼序列(CDS)進行預測。利用tRNAscan-SE v2.0[16]軟件(http://trna.ucsc.edu/software/)對基因組中包含的tRNA進行預測。

將預測得到的編碼基因與數據庫NR[17]、Swiss-Prot[18]、KEGG[19]比對進行功能基因注釋。

1.3.8 生物信息分析

氨基酸合成代謝途徑參照KEGG通路數據庫進行挖掘;Uniprot(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)數據庫中下載蛋白序列,使用本地BLASTP確認各基因在該基因組中的存在情況。

1.3.9 數據統計與分析

試驗中每個實驗值的測定均為3次平行實驗的平均值,以平均值±標準偏差來表示,在后期的統計分析中不再重復強調。

2 結果

2.1 兩歧雙歧桿菌對不同氮源的利用效果

按照1.3.2的方法測定菌株對單位質量不同氮源的增殖效果,結果如表1所示。兩歧雙歧桿菌F35對胰蛋白胨、魚蛋白胨以及牛骨蛋白胨表現最高的利用效率,其次是魚骨蛋白胨、大豆蛋白胨和胰酪蛋白胨,但是對酵母浸粉類氮源的利用效果很差甚至幾乎不利用。

表1 不同氮源培養基對兩歧雙歧桿菌F35生長的影響Table 1 Effects of different nitrogen sources on the growth of B.bifidum F35

2.2 氮源分子質量組成

通過高效液相色譜法對不同氮源的分子質量分布進行測定,結果如表2所示。酵母浸粉888和酵母浸粉803氨基酸含量分別高達63.19%和66.99%,為胰蛋白胨、胰酪蛋白胨、大豆蛋白胨、魚骨蛋白胨和牛骨蛋白胨5種氮源的2倍多,甚至達到魚蛋白胨(12.61%)的5倍以上。

表2 氮源的分子質量分布Table 2 Molecular weight distribution of nitrogen source

此外,酵母浸粉888和酵母浸粉803中分子質量180～2 000 Da的多肽成分占比分別為36.82%和32.94%,僅為其他6種氮源中含量的一半。

2.3 不同類型氮源對菌株的增殖效果

如表3所示,從含有游離氨基酸的培養上和含有酪蛋白水解物的培養基上所獲得的生長結果可以看出,生長至24 h時,游離氨基酸組幾乎未表現生長(OD600<0.20),而酪蛋白水解物組已達到生長穩定期,且最終生長值遠低于酪蛋白水解物組。

表3 不同類型氮源對兩歧雙歧桿菌F35生長的影響(OD600)Table 3 Influence of different types of nitrogen sources on growth of B.bifidum F35(OD600)

酪蛋白水解物的分子質量分布如表4所示,酪蛋白水解物中180～2 000 Da的多肽含量高達88.63%,當酵母浸粉888與其1∶1復配后,相較于酵母浸粉888單一氮源組,兩歧雙歧桿菌生長值及生長效率顯著提高。

表4 酪蛋白水解物分子質量分布Table 4 Molecular weight distribution of casein hydrolysate

2.4 氨基酸轉運及生物合成

如表5所示,兩歧雙歧桿菌基因組中存在著許多編碼氨基酸轉運系統的基因,以滿足菌株生理代謝需求。兩歧雙歧桿菌可以通過谷氨酸ABC型轉運系統轉運谷氨酸,該系統主要是由4個蛋白組成,即ATP結合蛋白(GluA)、2個細胞膜蛋白(GluC、GluD)、細胞外溶質結合蛋白(GluB)。脂肪族氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)可以由轉運系統AroP轉運進入細胞內。蛋氨酸ABC型轉運系統可以將蛋氨酸轉運進入細胞內,該系統由底物結合蛋白(MetQ)、滲透酶蛋白(MetI)以及ATP結合蛋白(MetN)。半胱氨酸可以由相應的TcyP轉運系統轉運進入細胞內以滿足菌株生長需求。

表5 兩歧雙歧桿菌F35的氨基酸轉運系統Table 5 Amino acid transport system of B.bifidum F35

在細菌中,一般至少存在2種類型的支鏈氨基酸轉運蛋白,一種是高親和力的ABC型轉運蛋白,另一種是低親和力的支鏈氨基酸滲透酶[20-21]。在兩歧雙歧桿菌中僅存在具有低親和力的BrnQ和YhdG蛋白,這2種滲透酶均具有轉運支鏈氨基酸的能力[22-23],同時還可以在一定程度上轉運蛋氨酸。

兩歧雙歧桿菌F35的18種氨基酸生物合成途徑注釋結果表明,除半胱氨酸外,該菌株具有利用分支酸、草酰乙酸、丙酮酸等物質合成其他17種氨基酸的的完整生物合成途徑,因此該菌株具有合成這17種氨基酸的能力,其相關基因的分布情況如圖1 所示。

2.5 氨基酸營養缺陷型分析

為了從表型上對兩歧雙歧桿菌氨基酸生物合成分析結果做進一步驗證,采用1.3.5的方法進行測定,結果如圖2所示。當兩歧雙歧桿菌在CDM上培養時,其最高生長值(OD600=0.57±0.02)比在含豐富氮源的MRS上培養時所獲得的最高生長值(OD600=1.73±0.17)明顯降低,且增殖時間由MRS上的24 h延長至72 h,增殖效率顯著降低。僅當剔除或者添加Cys時,所獲得的生長值會發生顯著降低(OD600<0.20)或升高。

2.6 氮源的氨基酸組成及其對菌株生長的影響

對8種氮源的游離氨基酸組成分析,結果如表6。結果表明,8種氮源中游離氨基酸種類不存在差異性,但酵母浸粉類氮源中疏水性氨基酸的總量顯著高于其他幾種氮源,為其他各氮源中疏水性氨基酸總量的2倍以上。

疏水性氨基酸對菌株生長的影響的探究結果如圖3所示,當CDM中剔除疏水性氨基酸后,獲得的最大生長值高出全氨基酸培養基組29%。

圖1 兩歧雙歧桿菌氨基酸生物合成相關基因分布圖Fig.1 Distribution of genes related to amino acid biosynthesis of B.bifidum

CDM-AA-化學合成培養基中剔除該氨基酸； bCDM+AA-基礎化學合成培養基上添加該氨基酸圖2 兩歧雙歧桿菌F35在CDM上的生長情況Fig.2 Growth of B.bifidum F35 on CDM

圖3 疏水性氨基酸對兩歧雙歧桿菌F35生長的影響Fig.3 Effect of hydrophobic amino acids on growth of B.bifidum F35

3 討論與結論

通過不同氮源對兩歧雙歧桿菌F35的增殖結果可以看出,兩歧雙歧桿菌F35對不同氮源的利用存在偏好性。氮源在菌株生長過程中為其提供氨基酸、多肽等營養物質以滿足其生長需求,由于雙歧桿菌較弱的蛋白水解活性,故其增殖速度的快慢與培養基中所含有的游離氨基酸和小分子肽的含量密切相關。對氮源的分子質量組成的進一步研究發現,酵母浸粉類氮源中游離氨基酸含量為其他氮源的2～5倍,但2 000 Da以下小分子肽含量僅為其他氮源的一半,TURRONI等[24]曾報道肽鏈的長短是決定肽促進乳酸菌生長活性強弱的一個重要因素;張清麗[25]在研究酪蛋白肽對乳酸菌的促生長作用時也發現,分子質量<3 kDa的成分是酶解物中主要的促生長因子;此外,PROULX等[26]還發現,最適于促進雙歧桿菌生長的商業酪蛋白水解物中99.6%的肽分子質量<2 kDa。

表6 氮源的游離氨基酸組成分析 單位：g/100 g

續表6

通過利用不同類型的氮源來培養兩歧雙歧桿菌F35,實驗發現酪蛋白水解物比只含氨基酸的混合物對兩歧雙歧桿菌表現出更好的增殖效果,該菌株利用多肽的增殖效率高于氨基酸,該結果與PROULX等[26]、KONGO等[27]的研究結果一致,他們分別報道了酪蛋白水解物和酶解乳清比游離形式的氨基酸對雙歧桿菌生長的促進作用要好。將180～2 000 Da的多肽含量高達88.63%的酪蛋白水解物與酵母浸粉888以1∶1比例復配后,相較于酵母浸粉888單一氮源,培養基中180～2 000 Da的多肽含量大大升高,從而提高了兩歧雙歧桿菌生長值及生長效率。可見,高含量的180～2 000 Da的多肽有利于兩歧雙歧桿菌的增殖,而酵母浸粉類氮源中該組分含量較低是導致兩歧雙歧桿菌生長效果差的原因之一。

當具有有效增殖作用的多肽含量較少時,菌株的生長與其培養基中游離氨基酸密切相關,但酵母浸粉類氮源中高含量的游離氨基酸卻不能被菌株有效利用。對兩歧雙歧桿菌F35氨基酸生物合成及轉運的分析發現,該菌株具有17種氨基酸的合成能力和豐富的氨基酸轉運系統,此外,在該菌株的基因組中缺失編碼絲氨酸轉乙酰酶(EC:2.6.1.51)和O-乙酰基絲氨酸裂解酶(EC:2.5.1.47)的基因,前者可催化絲氨酸發生乙酰化反應,生成O-乙酰基-L絲氨酸(O-acetylserine,OAS),后者可催化OAS和硫化物反應生成半胱氨酸[28],故該菌株不具備合成半胱氨酸的能力,但可以通過相應轉運蛋白TcyP轉運進入細胞內以滿足菌體生長需求。氨基酸營養缺陷型分析實驗中,僅當剔除或者添加Cys時,所獲得的生長值會發生顯著降低(OD600<0.20)或升高,結果表明兩歧雙歧桿菌F35僅表現為半胱氨酸營養缺陷型,也進一步證明在該菌株中其他17種氨基酸生物合成途徑的完整性。

氨基酸轉運及生成能力的完整性表明了菌株對于氨基酸的可利用性,酵母浸粉類氮源中高含量的游離氨基酸仍不能有效促進菌株的生長。對氮源的氨基酸組成分析結果發現,酵母浸粉類氮源的疏水性氨基酸含量為其他氮源的2倍以上,為探究疏水性氨基酸對兩歧雙歧桿菌F35生長的影響,將CDM中疏水性氨基酸剔除后觀察菌株的生長情況,結果表明疏水性氨基酸混合物的存在,對兩歧雙歧桿菌F35以氨基酸為氮源的生長具有一定程度的抑制作用;再結合表3可以發現,疏水性氨基酸會抑制菌株對氨基酸的利用,但是對于肽的利用沒有影響。先前研究中也出現過類似現象,BRAUN等[29]曾研究發現疏水性氨基酸Ile、Leu、Phe、Met可以引起衣原體Val可逆的生長抑制,衣原體BrnQ轉運蛋白競爭性抑制纈氨酸攝取是疏水性氨基酸抑制衣原體生長的主要作用機制;此外STUCKY等[30]對德氏乳桿菌乳亞種DSM7290的BrnQ轉運蛋白的研究中發現,異亮氨酸、纈氨酸對于亮氨酸的攝取具有同樣的抑制作用;在谷氨酸棒桿菌VAL1中也存在類似的疏水性氨基酸競爭性抑制作用[31]。

綜上所述，兩歧雙歧桿菌F35對不同氮源的利用存在偏好性,對富含氨基酸的酵母浸粉類氮源幾乎不利用,偏好利用富含多肽的蛋白胨。其利用多肽的增殖效率高于氨基酸;大量疏水性氨基酸的存在會抑制菌株以氨基酸為氮源的增殖,但是不會影響菌株對多肽的利用。兩歧雙歧桿菌F35基因型及表型均表現為半胱氨酸營養缺陷型;其基因組中存在豐富的編碼氨基酸轉運系統的基因,且存在17種氨基酸完整的生物合成途徑,以滿足菌體生理代謝需求。