褐色發酵乳中5-羥甲基糠醛相關性分析及應用

薛瑞琪,夏小樂*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

褐色發酵乳是以還原糖和生牛乳/脫脂乳粉為主要原料,輔以甜味劑和穩定劑,經高溫褐變與乳酸菌發酵而成的一種風味發酵乳[1],在保留酸奶香甜氣味的同時,增加了焦糖香氣與棕色色澤,受到消費者的廣泛喜愛[2]。但在高溫下,褐色發酵乳產生獨特風味的同時也會生成人體危害物——5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,5-HMF)[3-4],作為美拉德反應中間產物,5-HMF具有一定的神經毒性和遺傳毒性,會刺激眼睛、上呼吸道、皮膚和黏膜,并增加患癌癥的風險[5-7]。

不同食品中5-HMF含量差距較大,啤酒、威士忌等酒精飲料中5-HMF含量大約為5～50 mg/L,在餅干中其含量約為1.75～35.21 mg/kg,而在咖啡、黑蒜等食品中含量較高,可達100 mg/kg以上。由于5-HMF對人體有毒副作用,其在多種食物中已有明確限量標準,兒童果汁中5-HMF含量的強制性標準與建議性標準分別為20 mg/kg與5～10 mg/L[8],蜂蜜中的最大限量為40 mg/kg[9]。而褐色發酵乳作為新興的液態乳,尚未出臺5-HMF的限量標準。但由于其主要消費人群為青少年和兒童,安全性亦受到了研究人員的廣泛關注[10-11]。在其生產過程中,5-HMF與風味物質均由美拉德反應生成[6],因此部分5-HMF調控手段會影響美拉德反應程度,這在一定程度上制約了褐色發酵乳的發展[12]。

本文分析了不同市售液態乳中5-HMF含量與理化指標之間的相關性,同時探究了主要相關反應物在褐色發酵乳生產中對于5-HMF積累的影響。在此基礎上,形成了低還原糖、高氮的褐色發酵乳配方，以降低5-HMF含量并保證合適的美拉德反應程度。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

原料:液態乳(17種)、脫脂乳粉,均于當地超市購買。

5-HMF標準品,梯希愛(上海)化成工業發展有限公司;蔗糖、酪蛋白酸鈉、酪蛋白,上海麥克林生化科技有限公司;葡萄糖、半乳糖、乳糖、草酸(HPLC級)、醋酸鋅、亞鐵氰化鉀、賴氨酸、精氨酸、組氨酸等,中國醫藥集團化學試劑有限公司

高效液相色譜儀(chromaster),日本日立公司;超聲波清洗儀(SB-4200DT),寧波新芝生物科技股份有限公司;電熱恒溫水槽(DK-8D),上海精宏實驗設備有限公司;pH計(FE28),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;臺式高速離心機(TG 1850-WS),上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 褐色發酵乳制作工藝

褐色發酵乳的制作工藝如圖1所示。將脫脂奶粉(用量為120 g/L)和葡萄糖(用量為60 g/L)溶解在40～45 ℃的溫水中并攪拌。95 ℃下加熱180 min,加熱結束后水浴冷卻。之后接種Lactobacillusacidophilus,37 ℃下發酵12 h,發酵結束后冷藏后熟,并與甜味劑和穩定劑混合,制成褐色發酵乳。

1.2.2 液態乳中5-HMF及理化指標檢測

賴氨酸的測定采用鄰苯二甲醛法[13],褐變指數的測定采用高精度分光測色儀[14],酸度測定參照 GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》,蛋白質含量測定使用考馬斯亮藍法[15],5-HMF測定參照NY/T 1332—2007 《乳與乳制品中5-羥甲基糠醛含量的測定 高效液相色譜法》。

糖類物質的檢測采用高效液相色譜法,樣品的前處理使用Carrez試劑沉淀蛋白[16],處理后的樣品按以下色譜條件進行進樣分析:

色譜柱為Agilent Hi-Plex Ligand-Exchange 有機酸柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫60 ℃,流速1.00 mL/min,進樣量10 μL,檢測器為示差檢測器,流動相為超純水。

1.2.3 不同美拉德反應底物對于褐色發酵乳中5-HMF的影響

糖含量的影響:分別將添加量為120 g/L脫脂乳粉與20～100 g/L的葡萄糖、乳糖、半乳糖、蔗糖混合,用1.2.1中的方法制作褐色發酵乳。

蛋白質與氨基酸影響:利用1.2.1中的方法制作褐色發酵乳,制作過程中分別添加0.1～2 g/L的賴氨酸、精氨酸、組氨酸或5～30 g/L的酪蛋白。

所有樣品按1.2.2中方法檢測5-HMF。

1.2.4 褐色發酵乳中5-HMF含量的控制

分別按照表1的工藝配方制作褐色發酵乳,除所列條件外,其余工藝與1.2.1中的方法相同。樣品制作結束后按1.2.2中方法進行5-HMF含量與理化指標的檢測。

表1 褐色發酵乳配方及編號Table 1 Formula and serial number of brown fermented milk

1.3 數據分析

每個實驗重復3次,數據表示為平均值±標準誤差。使用Origin 2016 軟件進行繪圖;使用SPSS 19.0 軟件對5-HMF與理化指標(糖含量、pH、酸度、蛋白質和賴氨酸)和褐變指數進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 市售液態乳中5-HMF含量

本研究選取了17種不同類型市售液態乳,對其5-HMF含量進行分析(圖2)。在市售液態乳中,5-HMF含量主要與液態乳的類型密切相關。褐色乳中5-HMF含量遠大于普通牛乳,其中在褐色酸奶中5-HMF質量濃度為8.26～15.36 mg/L,在褐色乳飲料中較高,可以達到42.21～54.95 mg/L,而普通酸奶中僅為2.96～4.10 mg/L,純牛奶與風味乳中未檢測出5-HMF。兒童果汁中5-HMF強制性標準與建議性標準分別為20 mg/kg與5～10 mg/L,對比可知,普通牛乳中5-HMF含量較低,不存在安全風險。而褐色乳由于生產過程中經歷了高溫褐變過程,5-HMF含量已接近甚至超過強制性標準,因此主要研究褐色發酵乳中的5-HMF。

市售液態乳中理化指標檢測結果如表2所示。純牛奶中糖含量較低(53.16～55.37 g/L),大部分為乳糖,未經高溫褐變與乳酸菌發酵,因而顏色純白,pH偏中性(6.48～6.71)。而其余液態乳制品中添加了一定量糖,且均經乳酸菌發酵(一種風味乳除外),因此pH較低,糖含量較高。其中褐色乳飲料糖含量最高(150.02～158.03 g/L),pH最低(3.57～3.71),這可能是其5-HMF含量最高的主要原因。褐色酸奶中糖含量為118.31～143.67 g/L,普通酸奶多為95 g/L左右,2種酸奶pH為4.02～4.44。此外,褐色乳在制作過程中經歷了高溫褐變過程,顏色呈棕黃色,與其余液態乳相比,褐變指數較高(27.58～38.88)。

圖2 不同類型牛乳中5-HMF濃度Fig.2 5-HMF concentration in different types of milk

表2 不同類型牛乳中的理化指標Table 2 Physicochemical parameters in different types of milk

對市售液態乳中5-HMF含量和理化指標進行相關性分析(Pearson),來探究不同因素與5-HMF含量之間的關系(圖3)。糖含量、酸度、以及褐變指數與5-HMF含量呈正相關。其中,糖是5-HMF生成的主要前體,可通過美拉德反應,脫水縮合等反應生成5-HMF,兩者呈極顯著正相關(P<0.01)。酸度的升高可以顯著降低pH,從而影響液態乳中5-HMF的生成,褐變指數作為美拉德反應標志之一,與5-HMF顯著正相關(P<0.05)。此外,pH與5-HMF呈負相關,較低的pH會加快5-HMF的積累,在pH較高時,美拉德反應會遵循還原酮或羰基化合物路徑,不再生成5-HMF。賴氨酸、蛋白質與5-HMF呈負相關,這是由于過多的氨基化合物可與5-HMF反應生成類黑素等。

圖3 牛乳中5-HMF和理化指標的相關性分析Fig.3 Correlation between 5-HMF and physicochemical parameters in milk注:*表示在 0.05 水平(雙側)上顯著相關;**表示在0.01 水平(雙側)上顯著相關

2.2 不同美拉德反應底物對于褐色發酵乳中5-HMF含量影響

通過相關性分析發現,糖、氨基酸以及蛋白質含量是影響褐色發酵乳中5-HMF重要因素,且均為美拉德反應重要底物,因此,分別探究了其對褐色發酵乳中5-HMF含量的影響。結果如圖4-a所示,半乳糖與葡萄糖對于5-HMF含量的影響較為顯著,乳糖的影響相比較小,蔗糖的影響最低。當半乳糖、葡萄糖、乳糖與蔗糖添加量為20 g/L時,褐色發酵乳中5-HMF質量濃度分別為8.84、4.51、2.46與2.18 mg/L。在添加量為增加至100 g/L時,5-HMF分別達到35.28、25.53、5.02與3.45 mg/L。由此可知,糖含量對褐色發酵乳中5-HMF的影響十分顯著。而當褐色發酵乳制作過程中分別額外添加0.1～2 g/L的賴氨酸、精氨酸與組氨酸(美拉德反應能力較強的3種氨基酸)時,5-HMF質量濃度在10.48～13.07 mg/L無規律波動(圖4-b),說明氨基酸對于褐色發酵乳中5-HMF含量無明顯影響。在酪蛋白的添加量為10 g/L時,5-HMF質量濃度達到最大值14.06 mg/L,此后,隨著酪蛋白含量的增加,5-HMF不斷降低。這可能是過量的氨基化合物和5-HMF繼續反應,使美拉德反應進行到高級階段,生成類黑素等[17-18]。

圖4 糖(a)、蛋白質(b)、氨基酸(c)含量對褐色發酵乳中5-HMF濃度的影響Fig.4 Effect of sugar (a),protein (b),and amino acid (c) content on 5-HMF concentration in brown fermented milk

2.3 褐色發酵乳中5-羥甲基糠醛的控制

由于含糖量與5-HMF生成顯著相關,可以通過降低含糖量來調控褐色發酵乳中5-HMF的含量,但這種方法也會顯著抑制美拉德反應,從而影響產品的風味和顏色。蛋白質作為美拉德反應重要底物之一,不會造成5-HMF含量的劇烈增加。因此,在褐色發酵乳制作過程中添加酪蛋白酸鈉以促進美拉德反應,從而建立新的生產工藝。不同工藝對于5-HMF與褐變指數的影響如圖5所示,葡萄糖的減少與酪蛋白酸鈉的添加能在現有工藝的基礎上顯著降低5-HMF含量,同時溫度升高與酪蛋白酸鈉的增加能保證褐變指數的基本不變。綜上所述,當不添加葡萄糖,酪蛋白酸鈉添加量為15 g/L,褐變溫度為98 ℃時,對于褐變指數影響最小(40.99),且使5-HMF質量濃度降至1.86 mg/L。

圖5 不同褐色發酵乳中5-羥甲基糠醛濃度(a)及褐變指數(b)的比較Fig.5 Comparison of 5-HMF concentration (a) and browning index (b) of different brown fermented milk注:紅線為原有工藝的5-HMF濃度和褐變指數

不同工藝對于褐色發酵乳理化性質的影響如圖6所示。幾種褐色發酵乳的蛋白質與葡萄糖含量有一定差異,這主要是制作過程中不同添加量導致的,對于產品品質影響較小。但在乳糖含量及酸度方面差異較小,表明新工藝并未影響乳酸菌的生長與產酸,能保證褐色發酵乳的基本性質。新工藝制作過程中添加的酪蛋白酸鈉是一種富含必需氨基酸(6.33 g/15 g)的優質蛋白質,因而更能滿足人們的營養和健康需求。

圖6 不同褐色發酵乳理化指標的比較Fig.6 Comparison of physicochemical parameters of different brown fermented milk

3 結論

褐色發酵乳因其富含糖、蛋白質等美拉德反應底物,且在制作過程中經歷長時間的高溫加熱處理,極易發生美拉德反應,生成5-HMF。本研究通過分析市售液態乳中5-HMF的含量,發現褐色發酵乳中5-HMF含量遠高于其他種類液態乳;5-HMF與理化指標的相關性分析結果表明,糖、氨基酸、蛋白質美拉德反應底物等均與5-HMF顯著相關。因而分析了底物對褐色發酵乳制作過程中5-HMF積累量的影響,發現糖含量可顯著影響5-HMF的積累,而蛋白質與氨基酸影響較小?；谏鲜鼋Y論,確定了低還原糖、高氮的褐色發酵乳新配方,新配方可使5-HMF形成顯著降低,且保留了適宜的酸度和褐變指數。

由于褐色發酵乳體系復雜,僅靠相關性分析難以完全闡明其中5-HMF的生成規律,今后的研究可以通過多級響應動力學等手段來解析乳制品以及其他熱加工食品中美拉德反應與5-HMF的形成規律與機制,以期更好地平衡美拉德反應程度與危害物生成間的關系。