海洋魚骨膠原低聚肽及杜仲協同氨基葡萄糖-硫酸軟骨素對去勢大鼠骨密度及骨代謝的影響

夏凱,周志橋,李海枝,馬喜山,吳逸民, 苑鵬,劉士偉,段盛林*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司,北京 100015) 2(功能主食創制與慢病營養干預北京市重點實驗室,北京 100015)

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種骨代謝性疾病,以低骨量和骨組織微結構退行性改變為主要特征,臨床多表現為骨脆性增加和易骨折,在中老年人群中十分常見,尤其是絕經后婦女[1-2]。骨質疏松作為一個日趨嚴峻的公共健康問題已成為大家關注的焦點[3]。補充鈣質和維生素D能改善骨質疏松、避免骨質疏松及骨折的發生,但單純補充鈣質對改善骨密度(bone mineral density,BMD)及降低骨質疏松、骨折發生率的效果并不理想[4]。

氨基葡萄糖和硫酸軟骨素是軟骨組織的重要組成成分,是有助于提升骨關節健康的膳食成分,具有預防和治療骨關節炎的作用[5-8],但兩者聯用治療骨質疏松和提高絕經后女性骨密度時,存在起效較慢、用藥劑量大、服用周期長等問題[9-10]。海洋魚骨膠原低聚肽是以海洋魚骨為原料的低聚肽產品,由2～6個氨基酸組成,可以直接被機體吸收利用,且魚骨膠原蛋白肽可以促進卵巢切除大鼠的鈣吸收,增加股骨中鈣含量,起到增強骨密度的作用[11-12]。杜仲是我國的傳統中藥,杜仲能夠促進成骨細胞增殖,激活骨重建,改善骨代謝,防治OP[13]。目前,關于海洋魚骨膠原低聚肽和杜仲在骨相關疾病方面已有一定的研究基礎和運用,但兩者是否會對氨基葡萄糖-硫酸軟骨素經典組合在增加骨密度和改善骨代謝方面起到協同增效的作用,尚未見文獻報道。

本研究旨在評價海洋魚骨膠原低聚肽與杜仲提取物聯合氨基葡萄糖-硫酸軟骨素復合物改善去卵巢大鼠的骨密度和骨代謝的作用,以期為防止骨質疏松相關產品的開發及臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑

鹽酸氨基葡萄糖,江蘇九壽堂生物制品有限公司;硫酸軟骨素鈉,嘉興恒杰生物制藥有限公司;海洋魚骨膠原低聚肽,浙江海氏生物科技有限公司;杜仲,安徽佰順堂中藥飲片有限公司;戊巴比妥鈉,山東西亞化學股份有限公司;抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所;雌二醇(estradiol,E2)、骨鈣素(bone gla-protein,BGP)、降鈣素(calcitonin,CT)檢測試劑盒,北京百奧萊博科技有限公司;生理鹽水,江西科倫藥業有限公司。

1.1.2 儀器與設備

雙能 X射線QDR-4000型骨密度儀,美國Hologic公司;MK3型酶標儀,美國Thermo公司;羅氏Mdoular P型全自動生化分析儀,德國羅氏診斷有限公司;GS-6R型低溫臺式離心機,美國Beckman公司;DHG-9240A型電熱鼓風干燥箱,上海一恒科學儀器有限公司;MDS-6G型微波消解/萃取合成系統,上海新儀微波化學科技有限公司。

1.1.3 實驗動物

6～8周,體質量100～120 g的SPF級雌性SD大鼠60只,由北京大學醫學部實驗動物科學部提供,實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2016-0010。動物飼養于屏障環境中,飼養環境溫度為(23±2) ℃,濕度為40%～60%,明暗交替(12 h∶12 h)條件下適應性喂養1周后開始正式試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 杜仲提取物制備[14]

取杜仲1 kg,加入6倍量水浸泡30 min后煎煮1 h,過濾,保留濾液;殘渣繼續加入6倍量水煎煮1 h,過濾后合并2次濾液并進行減壓濃縮,濃縮液經噴霧干燥后制得杜仲提取物55 g。

1.2.2 實驗分組與造模

60只按照體重隨機分成假手術對照組、去卵巢對照組、氨基葡萄糖-硫酸軟骨素復合物組(受試物A組)、復合物+海洋魚骨膠原低聚肽組(受試物B組)、復合物+杜仲提取物組(受試物C組)、復合物+海洋魚骨膠原低聚肽+杜仲提取物組(受試物D組),每組10只。

各組大鼠手術[15-16]過程如下:①假手術對照組:腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液30 mg/(kg·bw)麻醉,腹位固定后于腹中線距陰道口3～4 cm處去毛并消毒,縱向切開皮膚,分離肌肉并用鑷子提起脂肪團,露出與子宮相連的卵巢并觀察,后逐層縫合切口并再次消毒;②去卵巢對照組及4個受試物組:麻醉及進入腹腔方法同上,露出與子宮相連的卵巢后,結扎并完整摘除雙側卵巢,余下組織送入腹腔內,后逐層縫合切口并再次消毒。

1.2.3 劑量設計

4個受試物組按照表1要求給予的受試物及劑量配制樣品液灌胃;假手術對照組及去卵巢對照組大鼠以等體積的去離子水灌胃。所有藥物給藥量均按人體推薦劑量的10倍折算,所有動物灌胃量為10 mL/(kg·bw),每天1次,連續灌胃90 d,每周稱重并結合體質量調整灌胃量。

表1 各試驗組受試物給予情況Table 1 Administration of test substance in each experimental group

1.2.4 觀測指標及方法

90 d后,麻醉大鼠后腹主動脈采血,將其離心后取血清,于-80 ℃保存備用。后處死大鼠,取出雙側股骨,于105 ℃烘至恒重,稱量左側股骨質量,并采用原子吸收分光光度法測定其骨鈣含量;測量大鼠右側股骨全長,通過其中點,沿橫截面方向畫一直線,此為股骨中心點測量點(截面),測定此處的BMD;于大鼠右側股骨遠心端關節凹槽最下緣處確定測量點,通過此點劃與上述股骨中點處標記平行的直線,此為股骨遠心端測量點(截面),測定此處的BMD[17-18]。

試驗采用全自動生化分析儀測定大鼠血清中Ca、P及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量[19],并根據各試劑盒中檢測方法,測定血清中TRAP、E2、BGP、CT的含量[20]。

1.3 數據處理與分析

采用SPSS 22.0進行統計學分析及處理,多組樣本間的差異采用單因素方差分析,t檢驗法,顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 一般觀察指標及體質量的變化

所有組別大鼠均存活。試驗期間,假手術對照組大鼠活動相對正常,毛色有光澤;去卵巢對照組大鼠活動力減弱,毛色光澤度下降,精神相對萎靡;與去卵巢對照組比較,各受試物組大鼠活躍度有所增強,毛色光澤度及精神狀態有一定程度改善。

由表2可見,第4周開始,與假手術對照組相比,去卵巢對照組及各受試物組大鼠體質量均有增加趨勢,但無顯著性差異;試驗第8周及試驗末,與假手術對照組相比,去卵巢對照組及受試物A、B、C和D組大鼠體質量均顯著增加(P<0.05),與去卵巢對照組相比,受試物A、B、C和D組大鼠體質量均有不同程度下降,但組間均無顯著性差異。

表2 受試物對大鼠體質量的影響(n=10)Table 2 Effects of test substance on the body weight of rats(n=10)

2.2 受試物對大鼠股骨質量及骨鈣的影響

由表3可見,與假手術對照組相比,去卵巢對照組大鼠股骨質量、骨鈣含量及總鈣量均顯著降低(P<0.05),表明大鼠骨質疏松模型構建成功。

表3 受試物對大鼠股骨質量及骨鈣的影響(n=10)Table 3 Effects of test substance on femur quality and bone calcium content in rats(n=10)

與假手術對照組相比,受試物A、B、C和D組大鼠骨鈣含量及總鈣量均顯著降低(P<0.05);與去卵巢對照組相比,受試物B、C和D組大鼠骨鈣含量及總鈣量均顯著增加(P<0.05),而受試物A組骨鈣含量及總鈣量增加但差異不顯著;與受試物A組比較,受試物D組大鼠骨鈣含量及總鈣量均顯著增加(P<0.05)。

2.3 受試物對大鼠股骨長度及骨密度的影響

由表4可見,各組大鼠股骨長度無顯著性差異。與去卵巢對照組相比,受試物B、C和D組大鼠股骨中心骨密度及股骨遠心端密度均顯著增加(P<0.05),而受試物A組呈增加趨勢但差異不顯著;與受試物A組相比,受試物D組大鼠股骨中心骨密度及股骨遠心端密度顯著增加(P<0.05);結果表明4組受試組均能提高骨密度,受試物D組改善效果最好。

表4 受試物對大鼠股骨長度及骨密度的影響(n=10)Table 4 Effects of test substance on femur length and bone mineral density in rats(n=10)

2.4 受試物對大鼠血清Ca、P及ALP含量的影響

血清ALP是常用的評價骨形成、骨轉換的指標。由表5可見,各組大鼠血清Ca、P含量均無顯著性差異;與假手術對照組比較,去卵巢對照組、受試物A、B和C組大鼠血清ALP含量均顯著升高(P<0.05),而受試物D組血清ALP含量差異不顯著;與去卵巢對照組比較,受試物B、C和D組大鼠血清ALP含量均顯著性降低(P<0.05),而受試物A組大鼠血清ALP含量呈下降趨勢但差異不顯著;與受試物A組比較,受試物C、D組大鼠血清ALP含量顯著降低(P<0.05)。

表5 受試物對大鼠血清Ca、P及ALP含量的影響(n=10)Table 5 Effects of test substance on Ca,P and ALP content in rats(n=10)

2.5 受試物對大鼠血清TRAP、E2、BGP及CT含量的影響

血清TRAP水平的檢測能反映破骨細胞的活性及骨吸收狀態,而BGP是由成骨細胞分泌,其數值的高低可反映成骨細胞的活躍度,血清BGP可作為評估骨轉換率及骨形成的特異性指標。因此由表6可知,與假手術對照組比較,去卵巢對照組大鼠血清TRAP及BGP含量均顯著升高(P<0.05),血清E2含量顯著降低(P<0.05);與去卵巢對照組比較,受試物B、C和D組大鼠血清TRAP及BGP含量均顯著降低(P<0.05),受試物C、D組大鼠血清E2含量顯著升高(P<0.05);與受試物A組比較,受試物D組大鼠血清TRAP和BGP含量均顯著降低(P<0.05),血清E2含量顯著升高(P<0.05),而受試物C組大鼠血清BGP含量顯著降低(P<0.05);各組大鼠血清CT含量無顯著性差異。

表6 受試物對大鼠血清TRAP、E2、BGP及CT含量的影響(n=10)Table 6 Effects of test substance on TRAP,E2,BGP and CT content in rats(n=10)

3 結論與展望

在本實驗條件下,去卵巢對照組大鼠的骨鈣含量、總鈣量和骨密度均顯著低于假手術對照組,其中骨密度是預測骨丟失的臨床指標,因此表明利用去卵巢手術成功建立了大鼠骨質疏松模型。海洋魚骨膠原低聚肽和杜仲提取物協同氨基葡萄糖-硫酸軟骨素復合物具有明顯的增加骨密度、改善骨代謝、提高雌激素水平的作用,且兩者聯合使用時,協同效果更加顯著。且在本研究中采用去卵巢致大鼠骨質疏松模型模擬絕經后骨質疏松的病理狀態,與去卵巢對照組相比,喂養添加杜仲提取物的大鼠體質量較其他組下降幅度大,且血清雌激素E2含量顯著升高,這可能是受試物中的杜仲提取物刺激了大鼠體內雌激素水平上升,從而在一定程度上抑制由于雌激素降低而誘發的體質量代償機制。

本研究首次探討了海洋魚骨膠原低聚肽及中藥杜仲聯合氨基葡萄糖-硫酸軟骨素復合物對去卵巢大鼠骨密度及骨代謝的影響。在動物試驗層面上,明確了其可增加骨密度、改善骨代謝等作用,為研究預防與骨質疏松相關疾病的功能性食品提供了理論基礎。