酪蛋白糖巨肽酶解產(chǎn)物抗氧化活性及其對(duì)RAW 264.7細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

唐麒雯,吳澤儀,余寧翔,葉沁,孟祥河*,聶小華*

1(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州,310014) 2(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所,浙江 杭州,310021)

氧化應(yīng)激是生物體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài),可造成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等氧化損傷而引起細(xì)胞凋亡,其已被證實(shí)與多種慢性疾病、衰老有著密切關(guān)系[1]。為此,應(yīng)用抗氧化活性物質(zhì)成為了降低生物體氧化損傷的一種策略。抗氧化肽源于食品蛋白質(zhì),由于具有資源豐富、穩(wěn)定性好、安全性高等優(yōu)勢(shì),逐漸備受關(guān)注。

酪蛋白糖巨肽(glycomacropeptide,GMP)是一種具有64個(gè)氨基酸殘基的糖肽,富含纈氨酸、亮氨酸等支鏈氨基酸,但幾乎不含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸[2];其主要糖基為唾液酸[3]。正因?yàn)镚MP獨(dú)特的氨基酸構(gòu)成,其酶解產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)與功能活性方面可能不同于其他蛋白酶解產(chǎn)物。近年來(lái)科研工作者開始關(guān)注GMP酶解產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)其具有益生、抗炎等功能活性,如GMP酶解產(chǎn)物可促進(jìn)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)[4];可通過(guò)阻斷NF-κb信號(hào)通路,抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中一氧化氮(nitric oxide,NO)產(chǎn)生和炎癥因子mRNA表達(dá),發(fā)揮抗炎作用[5]。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于GMP酶解產(chǎn)物的抗氧化性研究報(bào)道較少,僅CHENG等[6]采用木瓜蛋白酶酶解GMP,發(fā)現(xiàn)其酶解產(chǎn)物對(duì)RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞的氧化損傷有保護(hù)作用。基于此,本文擬采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶等商業(yè)酶制劑對(duì)GMP進(jìn)行降解,比較其酶解產(chǎn)物的自由基清除能力與抗氧化損傷能力,為GMP酶解產(chǎn)物功能食品配料開發(fā)提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GMP,丹麥Arla公司;中性蛋白酶、木瓜蛋白酶,上海瑞永生物科技有限公司;堿性蛋白酶,上海麥克林生化科技有限公司;RAW 264.7(小鼠巨噬細(xì)胞),中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所上海細(xì)胞庫(kù);2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-benzenesulfonic acid,TNBS)、2,2，-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS))、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)等試劑均為分析純,美國(guó)sigma公司;焦性沒(méi)食子酸,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MCO-17AC型二氧化碳培養(yǎng)箱,日本Sanyo 公司;CKX41型倒置光學(xué)顯微鏡、IX53型倒置熒光顯微鏡,日本Olympus公司;Synergy H1多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)Bio-TEK公司;ACB-4A1超凈工作臺(tái),南京非同科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 GMP酶解產(chǎn)物的制備

采用不同pH的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液配制30 g/L GMP溶液,按100 U/g添加量分別加入中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶,酶解條件見(jiàn)表1,酶解0.5、1、2、4、6 h后取樣,快速置于85 ℃下熱處理20 min使酶失活;而后快速冷卻至室溫,離心(10 000 r/min,20 min),上清液冷凍干燥,備用;酶解產(chǎn)物分別命名為N-GMPH、P-GMPH和A-GMPH。

表1 GMP的酶解參數(shù)Table 1 Enzymatic parameters of GMP

1.3.2 水解度

參考ADLER-NISSEN等的方法[7]。0.1 mL樣液中依次加入1 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 8.2)和1 mL 0.1% TNBS溶液,混勻,50 ℃下避光反應(yīng)60 min,而后加入2 mL 0.1 mol/L HCl溶液以終止反應(yīng),快速冷卻至室溫,340 nm處測(cè)定吸光度。以L-亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)公式(1)計(jì)算水解度:

(1)

式中:ω1,水解前的氨基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù),mg/g (蛋白);ω2,水解后的氨基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù),mg/g (蛋白);ω3,GMP完全水解后的氮質(zhì)量分?jǐn)?shù),mg/g (蛋白)。

1.3.3 抗氧化活性測(cè)定

1.3.3.1 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力

參考WANG等[8]的方法。取0.1 mL樣液與3.9 mL ABTS工作液混勻,室溫下避光反應(yīng)10 min,734 nm處測(cè)定吸光度。以蒸餾水為陰性對(duì)照,以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)公式(2)計(jì)算其ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性,且以維生素C當(dāng)量/mL來(lái)表示:

(2)

式中:A1,陰性對(duì)照吸光度;A2,樣液或陽(yáng)性對(duì)照吸光度。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力

(3)

式中:A1,陰性對(duì)照吸光度;A2,樣液或陽(yáng)性對(duì)照吸光度。

采用HOMAYOUNI-TABRIZI等[10]的方法。0.1 mL樣液與2.8 mL 1 mmol/L Tris緩沖液(pH 8.2)混合,加入0.1 mL 30 mmol/L焦性沒(méi)食子酸引發(fā)反應(yīng),室溫下反應(yīng)4 min。以蒸餾水為陰性對(duì)照,維生素C為陽(yáng)性對(duì)照,320 nm處每30 s測(cè)定其吸光度。

(4)

式中：V1,陰性對(duì)照氧化速率，Abs/min；V2,樣液或陽(yáng)性對(duì)照氧化速率，Abs/min。

河道縱向剖面規(guī)劃設(shè)計(jì)應(yīng)保護(hù)河道與河道、河道與湖塘之間的連通性，不設(shè)或少設(shè)擋水建筑物及構(gòu)筑物。對(duì)河道內(nèi)已建的壅水、阻水或影響河道排澇能力的建筑物，應(yīng)給予改（擴(kuò)）建或拆除。不能拆除的應(yīng)考慮通過(guò)改變運(yùn)營(yíng)方式等保持水流暢通，或修建跌水與魚道工程。

1.3.4 對(duì)H2O2誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

1.3.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW 264.7 細(xì)胞以RPIM1640(含10%胎牛血清,1%青霉素-鏈霉素雙抗)為培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.4.2 細(xì)胞存活率的測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞接種到96孔板(1×104/孔),在培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h后,分別加入100 μL樣液使其終質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.5、1 mg/mL,繼續(xù)培養(yǎng)12 h,再加入100 μL 400 μmol/L H2O2共培養(yǎng)6 h。采用MTT法[11]測(cè)定細(xì)胞活力。對(duì)照組中未加H2O2和樣液,其細(xì)胞存活率計(jì)為100%;雙氧水組未加樣液。

1.3.4.3 活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成量的測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞分別接種到96孔板(1×104/孔)和6孔板中(5×105/孔),在培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h后,加入樣液使終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL,培養(yǎng)12 h,然后加入100 μL 400 μmol/L H2O2共培養(yǎng)6 h。采用DCFH-DA法[12]測(cè)定細(xì)胞ROS生成量,同時(shí)使用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度。對(duì)照組中未加H2O2和樣液;雙氧水組未加樣液,其ROS生成量計(jì)為100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。采用GraphPad Prism 7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)(analysis of variance,ANOVA)及Tukey檢驗(yàn);P<0.05說(shuō)明統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶種類對(duì)GMP水解度的影響

蛋白酶種類對(duì)GMP酶解程度的影響如圖1所示。隨著酶解時(shí)間的增加,GMP酶解程度逐漸增加而后趨于平緩,其中中性蛋白酶對(duì)GMP的酶解作用明顯優(yōu)于木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶,后二者之間并無(wú)明顯差異。這可能是因?yàn)?(1)GMP分子中蘇氨酸、谷氨酸、脯氨酸等氨基酸殘基所占比例較高,基本不含酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸殘基[2];(2)蛋白酶作用位點(diǎn)不同,其中堿性蛋白酶作用位點(diǎn)主要為酪氨酸、苯丙氨酸、色丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等氨基酸殘基,木瓜蛋白酶作用位點(diǎn)主要為賴氨酸、精氨酸、甘氨酸和半胱氨酸等氨基酸殘基,而中性蛋白酶作用位點(diǎn)相對(duì)廣泛,并可酶切蘇氨酸殘基[13]。

當(dāng)酶解至4 h時(shí),水解度基本趨于平緩,中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶等對(duì)GMP的酶解程度分別為(11.82±0.58)%、(9.77±0.92)%和(9.01±0.58)%。該水解度低于已有的研究,如O’SULLIVAN等[14]采用堿性蛋白酶酶解酪蛋白,水解度可達(dá)(18.01±1.59)%,這是源于GMP獨(dú)特的氨基酸組成,其可供蛋白酶的作用位點(diǎn)較少。結(jié)果表明,中性蛋白酶對(duì)GMP的酶解程度較大。

圖1 蛋白酶種類對(duì)GMP酶解程度的影響Fig.1 Effects of protease type on enzymolysis degree of GMP

2.2 蛋白酶種類對(duì)GMP酶解產(chǎn)物自由基清除能力的影響

a-ABTS陽(yáng)離子自由基;b-DPPH自由基;圖2 蛋白酶種類對(duì)GMP酶解產(chǎn)物清除自由基能力的影響Fig.2 Effects of protease type on free radical scavenging ability of GMP hydrolysate

2.3 對(duì)H2O2誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

2.3.1 氧化模型的建立

H2O2進(jìn)入細(xì)胞后可轉(zhuǎn)化為·OH,具有較強(qiáng)的氧化能力,故常用H2O2建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。H2O2處理對(duì)RAW 264.7細(xì)胞存活率的影響如圖3所示。結(jié)果表明,隨著H2O2濃度的增加,細(xì)胞存活率下降,說(shuō)明其誘導(dǎo)了細(xì)胞的氧化損傷。其中400 μmol/L H2O2可降低細(xì)胞存活率降至(54.72±0.45)%,因此選擇400 μmol/L濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖3 H2O2處理對(duì)RAW 264.7細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of H2O2 treatment on RAW 264.7 cell viability

2.3.2 N-GMPH對(duì)H2O2誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞存活率的影響

GMP經(jīng)中性蛋白酶酶解4 h后,其酶解產(chǎn)物N-GMPH對(duì)RAW 264.7細(xì)胞存活率的影響如圖4所示。結(jié)果表明,GMP預(yù)處理對(duì)RAW267.4細(xì)胞存活率影響較弱,說(shuō)明其對(duì)細(xì)胞氧化損傷基本無(wú)保護(hù)作用;而N-GMPH預(yù)處理可顯著提高RAW 264.7細(xì)胞存活率(P<0.05),這是因?yàn)?(1)與GMP相比,N-GMPH本身具有更高的自由基清除能力(圖2);(2)N-GMPH含有較多的小分子肽,其容易發(fā)生跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),淬滅H2O2在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)代謝產(chǎn)生的ROS[19],從而發(fā)揮抗氧化損傷作用。凌玉芳[20]亦發(fā)現(xiàn),使用雙酶(胃蛋白酶-胰蛋白酶)對(duì)乳清蛋白進(jìn)行酶解,其酶解產(chǎn)物顯著提高細(xì)胞存活率,可改善H2O2所致的PC12細(xì)胞氧化損傷。

此外,N-PMPH對(duì)RAW 267.4細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用呈現(xiàn)濃度正相關(guān);當(dāng)酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為0.5和1 mg/mL時(shí),可將RAW 267.4細(xì)胞存活率提高至(79.32±1.85)%和(80.70±1.23)%,二者之間無(wú)顯著性差異。因此,選用質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL N-GMPH進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 N-GMPH對(duì)H2O2誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effects of N-GMPH on H2O2-induced RAW 264.7 cells viability 注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3.3 N-GMPH對(duì)H2O2誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)ROS生成量的影響

過(guò)量ROS會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡,導(dǎo)致氧化應(yīng)激,從而進(jìn)一步破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[21],所以ROS水平可用于反映細(xì)胞氧化損傷程度。GMP經(jīng)中性蛋白酶酶解4 h后,其酶解產(chǎn)物N-GMPH對(duì)H2O2誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)ROS生成量的影響如圖5所示。H2O2顯著提高了RAW 264.7細(xì)胞中ROS生成量,說(shuō)明細(xì)胞氧化損傷主要源于ROS的大量增加。GMP可降低ROS生成量,但下降程度僅為(6.29±0.76)%,這在一定程度上可解釋GMP對(duì)細(xì)胞氧化損傷無(wú)保護(hù)作用(圖4);而N-GMPH顯著減少細(xì)胞中ROS生成量至(44.50±2.29)%,該結(jié)果驗(yàn)證了其具有良好的抗氧化活性。

同時(shí),熒光倒置顯微鏡可觀察到(圖6),對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)弱綠色熒光,H2O2處理后則顯示出強(qiáng)烈的綠色熒光,意味著細(xì)胞中ROS水平明顯增加,進(jìn)一步證明H2O2誘導(dǎo)了細(xì)胞的氧化應(yīng)激;與H2O2組相比,0.5 mg/mL GMP與N-GMPH預(yù)處理后細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度均發(fā)生了不同程度的減弱,尤其是后者熒光強(qiáng)度顯著降低,該結(jié)果與細(xì)胞內(nèi)ROS生成量(圖5)基本一致。杜夢(mèng)霞[22]、馬萍等[23]亦發(fā)現(xiàn),豆類蛋白酶解產(chǎn)物可顯著降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。由此推測(cè),N-GMPH可通過(guò)消除細(xì)胞中ROS恢復(fù)胞內(nèi)氧化還原平衡,從而減輕胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等生命物質(zhì)的損傷,達(dá)到緩解H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷的作用。

圖5 N-GMPH對(duì) H2O2誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)ROS生成量的影響Fig.5 Effects of N-GMPH on ROS production of H2O2-induced RAW 264.7 cells

a-空白組;b-H2O2組;c-GMP;d-N-GMPH圖6 N-GMPH對(duì)H2O2誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響(200×)Fig.6 Effects of N-GMPH on ROS levels in H2O2-induced RAW 264.7 cells

3 結(jié)論