氧化亞油酸對肌原纖維蛋白膠凝行為及熱誘導凝膠體外消化率的影響

李保玲,李穎,朱振寶,黃峻榕,曹云剛

(陜西科技大學 食品與生物工程學院,陜西 西安,710021)

肉及其制品的質地特征是影響消費者做出購買決定的重要因素,占肌肉蛋白總量55%～65%的肌原纖維蛋白因為其優異的凝膠和乳化能力,對最終加工肉制品的質地特性起著主要決定作用[1]。因此在肉制品加工過程中,蛋白結構特征的變化及凝膠精細網絡的形成受到了廣泛關注[2-3]。在肉類食品加工過程中,肌肉細胞結構的破壞、分子氧的滲透以及游離鐵和血紅素鐵的釋放不可避免地導致了脂肪和蛋白質的氧化。長期以來人們對脂質的氧化進行了深入的研究,然而蛋白質作為活性氧(reactive oxygen species,ROS)或者其他過氧化物作用的靶點卻一直被忽視[4-5]。之前的研究主要聚焦于蛋白質氧化在年齡相關疾病中的作用[6-7],但目前越來越多的研究開始探討蛋白質氧化對食品質量的影響。ROS 被認為是與氨基酸側鏈基團的氧化修飾有關的原位因素,通常會導致蛋白質結構與功能性質的改變,包括持水性能、凝膠性能以及乳化性能等[5,8]。

由于原料肉中蛋白質和不飽和脂肪大量共存以及加工行為的破壞性作用,脂肪和蛋白的氧化極可能以相關聯的方式發生。相關研究表明,脂質氫過氧化物、脂質自由基以及衍生的醛類物質等都可以促進蛋白氧化的發生[9-10]。關于脂質氧化引起的肌原纖維蛋白(myofibrillar protein,MP)生化指標和蛋白消化率的變化已有大量研究報道[11-14],但是由脂質氧化產物導致的MP凝膠性能改變的現有研究結果并不一致,同時前人研究多集中于氧化對生蛋白消化率的影響,而現實生活中人們對肉食的攝入主要以熟食為主。因此,本實驗主要研究蛋白暴露在脂肪氧合酶——亞油酸氧化體系中所引起的MP結構以及凝膠性能的變化和氧化對蛋白熱誘導凝膠體外消化率的影響,以此進一步了解肉類及其制品中脂質氧化和蛋白質氧化之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

豬外脊肉(Longissimuslumborum),當地超市(陜西西安);大豆脂肪氧合酶、胰蛋白酶,美國Sigma-Aldrich公司;亞油酸(>95%)、胃蛋白酶,上海阿拉丁化學有限公司;其他試劑至少為分析純。

1.2 儀器與設備

HR/T20MM立式高速冷凍離心機,湖南赫西儀器裝備有限公司;TA.Plus物性測試儀,英國Stable Micro System公司;Fluoro Max-4 熒光分光光度計,日本 Horiba 公司;Mastersizer 2000激光粒度分析儀,英國Malvern Instruments有限公司;CM-5分光測色計,柯尼卡美能達(中國)投資有限公司;Haake-Mars 60 流變儀、DXR2顯微共聚焦拉曼光譜儀,德國Thermo Fisher Scientific公司;FEI Q45+EDAX Octane Prime環境掃描電子顯微鏡,美國FEI公司;安東帕LitesizerTM500納米粒度及Zeta電位分析儀,奧地利Anton Paar 公司。

1.3 MP的提取及樣品制備

1.3.1 MP的提取

肌原纖維蛋白的提取參照PARK等[13]的方法,使用雙縮脲法以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)作為標準測定蛋白濃度,將所得MP置于碎冰浴4 ℃保存并在48 h內使用。

1.3.2 蛋白的氧化處理

用25 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(含0.4 mol/L NaCl,pH 6.2)將MP稀釋至45 mg/mL,將MP溶液分散于脂肪氧化體系(含0.5～10.0 mmol/L 亞油酸,3 750 U/mL脂肪氧合酶,終濃度)使MP終濃度達到30 mg/mL,并于4 ℃反應12 h。通過添加Trolox(終濃度 1 mmol/L)來終止氧化反應,未添加氧化體系的MP溶液為空白對照。

1.4 脂質氧化的測定

參照SALIH等[15]的方法測定2-硫代巴比妥酸反應物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)含量,并以此來反映MP懸液中的脂質氧化程度。

1.5 MP的化學及結構變化

1.5.1 氨基酸殘基側鏈修飾

羰基含量采用CAO等[16]描述的2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH)比色法進行測定。

總巰基含量按照ELLMAN[17]的方法,采用5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB]進行測定。

自由氨基含量參照HABEEB[18]的方法,通過2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)試劑進行測定,同時使用一系列濃度的L-亮氨酸在相同條件下制成標準曲線,并通過繪制的標準曲線來計算蛋白樣品的自由氨基含量。

1.5.2 蛋白構象變化

內源性色氨酸熒光的測定:使用25 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(含0.4 mol/L NaCl,pH 6.2)將樣品稀釋至0.4 mg/mL,利用熒光分光光度計于波長283 nm激發并記錄290～400 nm的發射光譜,激發和發射狹縫寬度均設置為1.5 nm。相同條件下記錄溶劑發射光譜,并從樣品發射光譜中扣除以排除干擾。

1.6 Zeta電位和粒度測定

Zeta電位:利用電位分析儀進行測定,使用25 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含0.4 mol/L NaCl,pH 6.2)將樣品稀釋至1 mg/mL,取1 mL放入Univette樣品池,平衡時間設定為1 min,設置溶劑(磷酸鹽緩沖液)折射率為1.331 8,電泳溫度維持在25 ℃,梯度重復3次,取其平均值。

粒度測定:使用激光粒度分析儀在25 ℃下采用靜態光散射分析MP樣品的粒徑分布,去除測量背景后將稀釋后的MP樣品(2 mg/mL)分散在蒸餾水(分散介質)中,直至遮光效果達到10%～13%,設置MP顆粒折射率為1.434,分散劑折射率為1.330,測定樣品的平均粒度(d3,2和d4,3)。

1.7 溶解度

使用25 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(含0.4 mol/L NaCl,pH 6.2)將肌原纖維蛋白樣品稀釋至 2 mg/mL,然后在5 000×g條件下離心(15 min,4 ℃)。取上清液根據CAO等[1]的方法測定得到的蛋白樣品的溶解度。

1.8 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)

采用SDS-PAGE分析了蛋白質組分的氧化交聯、聚合或降解情況。實驗參照CAO等[19]的方法進行,使用4%濃縮膠和12%分離膠在還原(+DTT)和非還原(-DTT)條件下進行凝膠電泳,每孔上樣量20 μg,染色脫色后拍照并對電泳條帶進行分析。

1.9 凝膠性能測定

1.9.1 動態流變性能測定

將不同處理的MP樣品離心脫氣后(30 mg/mL,1 000×g,1 min),取適量樣品均勻涂布于流變儀的平板上,選用平行板傳感器P35(直徑35 mm)下壓至1 mm處,用紙去除周圍多余樣品,在邊緣涂上硅油防止水分蒸發,在振蕩模式下從 20 ℃加熱到 75 ℃,升溫速率:1 ℃/min,振蕩頻率:0.1 Hz,控制最大應變:0.02。凝膠性能通過儲存模量(G′)來進行評價。

1.9.2 蒸煮損失、凝膠強度和白度

將MP樣品(5 g,30 mg/mL)置于小玻璃瓶中使用保鮮膜密封后置于水浴鍋中,以1 ℃/min的升溫速率從20 ℃加熱至75 ℃,并在75 ℃保溫10 min,取出后立刻置于冰水混合物中冷卻30 min,隨后放入4 ℃冰箱冷藏過夜。蒸煮損失、凝膠強度和白度的測定參照CAO等[1]的方法進行。

1.9.3 MP凝膠微觀結構

將制備的MP凝膠切成小塊(5 mm×5 mm×5 mm),用含2.5%(體積分數)戊二醛的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)固定4 h,使用磷酸鹽緩沖液清洗3次,然后通過一系列濃度的乙醇溶液(50%,70%,90%,95%,100%體積分數)進行梯度脫水,每次30 min。在-70 ℃對樣品進行冷凍干燥,將干燥的樣品噴金后使用環境掃描電子顯微鏡(environmental scanning electron microscope,ESEM)觀察其微觀結構,加速電壓15 kV,放大倍數3 500倍。

1.9.4 MP凝膠的疏水相互作用和氫鍵作用

采用拉曼光譜對MP凝膠中760 cm-1附近的拉曼譜帶歸一化強度和830、850 cm-1處酪氨酸雙譜帶的相對強度進行了表征[20],探究氧化對MP凝膠疏水相互作用和氫鍵作用的影響,光譜數據由OMNIC軟件收集后使用LabSpec對所得光譜進行平滑、基線校正并用在1 003 cm-1處的苯丙氨酸環帶進行歸一化處理[21]。

1.9.5 MP凝膠的體外消化

參照曹云剛[22]的方法模擬胃-腸道消化對MP凝膠進行體外消化評價。取冷卻過夜的MP凝膠及其流出液5 g,磨碎后加入適量10 mmol/L的HCl溶液,在11 000 r/min條件下均質30 s,添加豬胃蛋白酶溶液(1 mg/mL,溶于10 mmol/L HCl溶液),所得混合溶液蛋白質量濃度為 3 mg/mL,胃蛋白酶濃度4%(質量分數,以蛋白含量為基準計算),pH 2.0。混勻后于37 ℃水浴鍋中酶解1 h,而后使用1 mol/L的NaOH溶液調節pH值至7.5來結束反應,而后添加4%(質量分數,以蛋白含量為基準計算)的胰酶溶液,繼續在37 ℃水浴鍋中反應2 h,反應結束后于沸水浴中加熱5 min以達到滅活的目的。消化反應期間分別在30、60、90、120、180 min時取樣,加入同等體積的30% (質量分數)三氯乙酸來終止反應沉淀蛋白,混合液在4 ℃冰箱中過夜,以11 000×g離心10 min后棄去上清液,于沉淀中加入1 mol/L的NaOH溶液來復溶蛋白沉淀,隨后使用雙縮脲法測定蛋白濃度。體外消化率計算如公式(1)所示:

(1)

式中:ct和cp分別指總蛋白濃度以及體外消化后三氯乙酸沉淀的蛋白濃度。

1.10 數據分析

所有的實驗至少獨立重復2次,每批次至少有3個獨立樣品。實驗數據使用Statistix 9.0分析軟件進行方差分析,采用LSD對多組數據進行顯著性分析,P<0.05表示差異有統計學意義。數據以平均數±標準差(mean±SD)表示,并使用Sigma Plot 12.5軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 脂質氧化

相關研究發現,多不飽和脂肪酸(亞油酸、亞麻酸等)在脂肪氧合酶的催化下發生脂質過氧化反應,形成自由基中間體和相關脂質氧化產物,進而促進MP氧化[12]。本研究采用TBARS法通過測定脂質氧化二級產物的含量來評價脂質氧化程度。如表1所示,未氧化MP的TBARS值為0.94 mg/kg蛋白,這與先前研究報告的值(0.79 mg/kg)相似[23]。總的來說,隨著OLA濃度的增加,脂質氧化MP樣品TBARS值不斷增加,在OLA濃度為10.0 mmol/L時,TBARS值達到最大(4.86 mg/kg),是對照樣品的5倍。這一結果說明OLA濃度的增加促進了脂質氧化反應的發生。

表1 不同OLA濃度下肌原纖維蛋白理化性質的變化Table 1 Changes in physicochemical properties of myofibrillar protein at different concentrations of OLA

2.2 MP樣品氨基酸殘基的側鏈修飾情況

2.2.1 羰基

蛋白質羰基含量的變化是反映蛋白質氧化程度的重要指標,它主要由氨基酸側鏈殘基和肽鍵的氧化斷裂產生[5]。OLA濃度對MP羰基含量的影響如表1所示,未氧化MP的羰基含量為3.33 nmol/mg,這一結果與JONGBERG等[24]研究的未氧化豬肉MP的羰基值相接近。然而,也有部分研究報道的未氧化豬肉MP的羰基值較低[11,14],推測實驗數據的不一致與實驗所用豬肉的品種及屠宰方式有關。與TBARS含量變化趨勢一致,隨著OLA濃度的增加,脂質氧化MP中羰基也在不斷生成,在OLA濃度為10.0 mmol/L時羰基含量達到最大值(8.99 nmol/mg,P<0.05),其他研究者也報道了脂質氧化MP中羰基含量的類似變化趨勢[11,14]。這些結果表明脂質氧化促進了蛋白氧化的發生,同時也證實了脂質氧化產物可以有效催化蛋白氧化的觀點。

2.2.2 總巰基

MP中巰基含量豐富,其暴露在氧化環境中易被轉變成分子內或分子間二硫鍵及其他相關化合物,使MP中總巰基含量下降,進而對蛋白的結構和功能性質造成影響[25]。如表1所示,未氧化MP中的總巰基含量為60.35 nmol/mg,與先前研究報道的值相似[14,19]。當MP暴露于脂質氧化體系中,隨著OLA濃度的增加,蛋白的總巰基含量穩步下降,與未氧化MP相比,OLA濃度為10.0 mmol/L時,總巰基含量下降約14.1%。類似的氧化引起MP總巰基含量降低的研究在各種氧化體系中已被廣泛報道[26-27]。

2.2.3 自由氨基

賴氨酸殘基的ε-NH2基團在氧化過程中通過脫氨作用轉化為羰基,然后形成的羰基與氨基反應生成席夫堿,進而導致游離氨基的含量持續下降[28]。如表1所示,MP暴露于脂肪氧化體系后游離氨含量顯著下降(P<0.05)。與未氧化MP相比,經過不同濃度OLA處理后(0.5、1.0、3.0和10.0 mmol/L)MP樣品自由氨基含量分別減少了15.2%、14.4%、17.6%和22.5%。脂質氧化導致了MP中羰基的形成、巰基和游離氨基的損失,表明脂質氧化產生的ROS對蛋白質具有廣泛的氧化攻擊作用。

2.3 MP內源性色氨酸熒光強度的變化

由于色氨酸殘基對周圍微環境的敏感性,內源性色氨酸熒光特性通常用于反映蛋白質結構的變化[29]。當蛋白質處于折疊狀態時,MP具有較大的熒光強度和較短的最大發射波長;當蛋白質結構展開時,色氨酸殘基暴露于極性環境中,其熒光強度降低、最大發射波長紅移(變長)。如圖1所示,隨著OLA濃度的增加,MP最大發射波長處的熒光強度逐漸降低,特別是當OLA濃度超過1.0 mmol/L時(P<0.05)。與此同時,與未氧化MP相比,當OLA濃度增加到10.0 mmol/L時,MP的最大發射波長從328.5 nm變為329.6 nm。推測可能的原因是隨著氧化的進行,蛋白質結構逐漸展開,MP中的色氨酸殘基等熒光基團暴露在極性環境中,導致MP樣品的色氨酸熒光強度降低。

圖1 不同OLA濃度下MP的色氨酸熒光強度變化Fig.1 Changes in tryptophan fluorescence intensity of myofibrillar protein at different concentrations of OLA

2.4 MP樣品Zeta電位和粒徑的變化

Zeta電位反映了MP溶液中蛋白粒子間的靜電相互作用,它與MP溶液的穩定性密切相關。本研究中MP樣品的Zeta電位均為負值(圖2-a),這與MP溶液的pH值高于蛋白等電點有關,陰離子主要來自于蛋白質顆粒表面的酸性氨基酸殘基(如天冬氨酸、谷氨酸等)。

a-Zeta電位;b-粒徑圖2 不同OLA濃度下MP的Zeta電位和粒徑變化Fig.2 Changes in Zeta potential and mean particle diameter of myofibrillar protein at different concentrations of OLA

與未氧化MP相比,隨著OLA濃度的增加,MP的Zeta電位絕對值不斷減小,說明蛋白粒子間的靜電作用力隨著氧化程度的增強而不斷減弱。

如圖2-b所示,通過測定MP樣品的平均粒徑d3,2和d4,3來評估氧化誘導的蛋白聚集行為。從圖中可以看到,隨著OLA濃度的增大,MP樣品的平均粒徑不斷增大。結合前文MP樣品溶液的內源性色氨酸熒光強度以及Zeta電位結果發現:氧化導致蛋白質去折疊化,暴露出帶電荷的氨基酸殘基與氧化產物反應生成電中性物質,從而使蛋白粒子間靜電相互作用減弱、蛋白質分子間的交聯聚集加劇,引起蛋白平均粒徑的增加。這一結果與周非白[30]關于羥自由基氧化體系誘導的MP氧化以及BAO等[31]使用不同濃度次氯酸誘導蛋白氧化實驗得到的MP平均粒徑變化趨勢相似。

2.5 MP溶解度的變化

MP的溶解度反映了蛋白質交聯、聚集程度的變化。脂質氧化程度對MP溶解度的影響如表1所示,未經氧化處理的MP溶解度為43.35%,而當MP暴露于脂質氧化體系后蛋白溶解度持續降低(P<0.05)。與未氧化MP相比,在OLA濃度逐步增加至0.5、1.0、3.0、10.0 mmol/L時,MP的溶解度分別下降了12.1%、7.2%、16.8%和43.3%。推測氧化后MP溶解度的降低主要與以下因素有關:疏水基團的暴露(圖1)、二硫鍵和其他共價鍵的形成,這些變化導致蛋白質之間的相互作用增強,分子間的交聯聚集加劇(圖2-b),從而降低了蛋白樣品的溶解度。

2.6 SDS-PAGE

不同濃度OLA處理下MP的SDS-PAGE圖譜如圖3所示。在非還原條件下(圖3-a,-DTT),隨著OLA濃度的增加,肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC)和肌動蛋白(actin)條帶強度穩步下降,同時在濃縮膠的頂部觀察到高分子質量聚合物的聚集,這一結果進一步解釋了亞油酸誘導的脂質氧化導致蛋白質溶解度降低的原因。如圖3-b(+DTT)所示,在還原條件下堆積在濃縮膠頂端的聚合物幾乎完全消失,MHC和actin條帶強度明顯增強,這一結果意味著氧化誘導形成的聚合物主要與MHC和肌動蛋白有關,同時也表明脂質氧化引起的MP總巰基含量的下降主要是由于二硫鍵的形成[26,32]。

1-0.5 mmol/L;2-1.0 mmol/;3-3.0 mmol/L;4-10.0 mmol/L圖3 不同OLA濃度下MP SDS-PAGE圖譜的變化Fig.3 Changes of SDS-PAGE patterns of myofibrillar protein at different concentrations of OLA

2.7 MP凝膠性能的變化

2.7.1 動態流變行為

MP懸浮液的流變特性可以反映蛋白質氧化對凝膠形成過程以及凝膠彈性的影響。不同氧化處理的MP懸浮液在加熱過程中的流變規律如圖4所示。未氧化MP樣品呈典型的G′曲線,在49 ℃左右達到一個過渡峰,在53 ℃左右出現一個低谷,隨后在53～75 ℃穩定上升。相關報道表明G′在49 ℃左右的第一個轉變峰是由肌球蛋白頭部的變性和聚集引起的[33],而約53 ℃出現的波谷則與輕酶解肌球蛋白變性有關,此后G′的持續增加則歸因于永久性和不可逆肌球蛋白絲或復合物的形成[33-34]。OLA的存在顯著降低了初始的G′和過渡峰G′值的大小,然而最終G′值并沒有顯著變化。

圖4 不同OLA濃度下MP的流變性能Fig.4 Rheological properties of myofibrillar protein at different concentrations of OLA

亞油酸誘導的脂質氧化導致蛋白官能團的修飾、蛋白質構象的變化以及MP聚集等現象的發生,從而改變了MP在加熱過程中的動態流變行為。

2.7.2 蒸煮損失、凝膠強度和白度

如表2所示,隨著OLA濃度的增加,MP凝膠的蒸煮損失逐漸上升。與未氧化MP相比,在向MP樣品分別添加0.5、1.0、3.0和10.0 mmol/L的OLA后,MP凝膠的蒸煮損失分別增加46.6%、73.8%、78.6%和131.1%(P<0.05)。與蒸煮損失的變化趨勢相反,MP的凝膠強度隨著OLA濃度的增加而逐漸降低,經0.5、1.0、3.0和10.0 mmol/L的OLA處理后,MP凝膠的初始斷裂力分別為對照組的82.1%、76.2%、75.0%和73.8%。推測隨著氧化強度的增加,MP分子間的交聯聚集加劇、溶解度不斷下降,這種情況影響了MP均勻牢固的凝膠網絡結構的形成,造成了MP蒸煮損失的增加以及凝膠強度的降低[19,35]。UTRERA等[36]研究發現氧化導致蛋白質羰基化,從而改變蛋白質的電荷特性,導致肌肉蛋白質的溶解度、保水性和凝膠特性降低,與本研究結果一致。

已有文獻報道表明蛋白的凝膠白度與蛋白質的變性程度相關[37]。如表2所示,凝膠白度隨OLA濃度的增加而顯著降低,經過0.5、1.0、3.0和10.0 mmol/L的OLA處理后的樣品凝膠白度分別為對照組的98.8%、98.4%、97.0%和95.5%。

表2 不同OLA濃度下MP的凝膠性能變化Table 2 Changes in gelling properties of myofibrillar protein at different concentrations of OLA

周非白[30]研究發現隨著過氧自由基含量的增加,MP的凝膠白度顯著降低,與本研究結果一致。XIA等[38]發現豬肉MP的凝膠白度隨肌肉冷凍-解凍循環次數的增加而顯著降低,作者認為這一現象與脂質氧化有關。而在真實的肉類體系中,ESTéVEZ等[39]發現法蘭克福香腸的顏色與肌肉蛋白的氧化直接相關。因此,本研究中MP凝膠白度的降低應與脂質氧化和蛋白氧化相關。

2.7.3 MP凝膠的微觀結構

蛋白質凝膠微觀結構的表征是研究MP凝膠特性的重要手段。不同OLA濃度對MP熱誘導凝膠微觀結構的影響如圖5所示,未氧化MP形成的凝膠網絡結構致密,微孔分布均勻。而OLA的添加對MP凝膠微觀結構的影響主要與其濃度相關,低濃度OLA的添加(0.5～1.0 mmol/L)對MP凝膠的微觀結構沒有顯著影響,而當OLA濃度從3.0 mmol/L增加到10.0 mmol/L時,MP凝膠的微觀結構發生顯著變化。當OLA濃度達到10.0 mmol/L時,MP凝膠的網絡結構變得粗糙且不規則,孔隙變大,凝膠網絡結構受到嚴重破壞。而MP凝膠松散、不規則的結構也導致了MP凝膠持水性能和凝膠強度的降低。加熱前MP的高強度氧化引起的蛋白過度聚集和溶解度降低是導致MP凝膠性能下降以及微觀結構粗糙不規則的原因。

圖5 不同OLA濃度下MP凝膠的微觀結構圖Fig.5 Microstructure of myofibrillar protein gels at different concentrations of OLA

2.7.4 拉曼光譜分析

760 cm-1(I760)附近的拉曼譜帶歸一化強度變化歸屬于色氨酸殘基的伸縮振動,其對色氨酸殘基周圍的微環境變化極其敏感,因此可用于研究MP凝膠的疏水相互作用[40]。如表3所示,與未氧化MP凝膠相比,經過0.5 mmol/L的OLA處理后MP凝膠的I760值增加了約41.8%(P<0.05),這一結果表明輕度氧化增強了MP凝膠的疏水相互作用,然而隨著OLA濃度的進一步增加,MP凝膠的I760值逐漸降低,表明過度氧化減弱了MP凝膠的疏水相互作用。

830和850 cm-1酪氨酸雙譜帶的相對強度(I850/I830)變化反應了苯環上酚羥基(—OH)的狀態和氫鍵的性質[40]。當雙峰的相對強度(I850/I830)比值較高(0.9～2.5),表明酪氨酸殘基暴露在水溶液或其他極性微環境中或者同時作為氫鍵受體以及中弱等氫鍵供體進行傳導,而較低的相對比值則表明酪氨酸殘基埋藏在疏水環境中或僅作為氫鍵供體來增強氫鍵作用[21]。如表3所示,I850/I830的比值在0.982～1.036,這說明酪氨酸殘基主要暴露在水溶液中并同時參與了中、弱氫鍵作用。需要注意的是,隨著OLA濃度的增加,I850/I830的比值由0.982增加到1.036,表明隨著氧化程度的加深,酪氨酸殘基的苯環上更多的—OH暴露于水環境中并與水分子形成氫鍵[41]。換言之,MP凝膠中蛋白-蛋白氫鍵隨著氧化程度的增加而減少。

表3 不同OLA濃度下MP凝膠I760的歸一化強度和I850/I830比率Table 3 Normalized intensity of the 760 cm-1band and ratio of 850/830 cm-1 doublet bands of myofibrillar protein gels at different concentrations of OLA

2.7.5 MP凝膠的體外消化測定

使用模擬胃和腸道消化的消化酶(胃蛋白酶、胰酶)來測定不同OLA濃度下MP熱誘導凝膠的消化率,結果如表4所示。在胃蛋白酶消化階段,與未氧化MP熱誘導凝膠相比,凝膠制備前的氧化處理對其最終消化率并沒有顯著性影響,當OLA濃度過大時(3.0～10.0 mmol/L),MP凝膠的消化率有少許下降。在胰蛋白酶消化階段,與未氧化MP熱誘導凝膠相比,OLA濃度為0.5 mmol/L時,蛋白在180 min時的消化率無顯著變化(P>0.05),而當OLA濃度>0.5 mmol/L時,MP凝膠的消化率顯著降低。這一結果也與周非白[30]在研究氧化對MP體外胃腸道消化率的結果類似,作者認為過度氧化條件下蛋白形成聚集體,同時造成了氨基酸的損失,因此導致蛋白體外消化率的降低。而曹云剛[22]研究氧化及沒食子酸添加對MP凝膠體外消化率的影響時發現,加熱前的氧化處理對MP凝膠的消化率無顯著影響,上述結果不一致，可能與實驗所用肉的種類、試劑的量比以及實驗條件的不同有關。

表4 不同OLA濃度下MP凝膠的體外消化率Table 4 In vitro digestibility of myofibrillar protein gels at different concentrations of OLA

3 結論

OLA誘導的蛋白氧化主要傾向于降低MP的凝膠性能,而這主要依賴于蛋白理化性質以及結構的改變。一般情況下,MP的氧化導致羰基的形成、總巰基和自由氨基含量的下降、Zeta電位絕對值的降低、蛋白質的去折疊化以及由此導致的蛋白粒徑的增大和溶解度的下降。同時,輕度的氧化對MP的膠凝特性沒有明顯影響,而加熱前MP的過度氧化會降低MP凝膠中蛋白顆粒間的疏水相互作用和氫鍵作用,從而降低了MP的凝膠性能以及蛋白凝膠的消化率。這些實驗結果為研究OLA誘導的MP結構變化及其與凝膠性能之間的關系提供了參考。