赤霉素對鮮切萵苣酶促褐變及活性氧代謝的影響

劉云芬,田天容,殷菲朧,廖玲燕,普紅梅,康超,帥良*

1(賀州學院 食品與生物工程學院/食品科學與工程技術研究院,廣西 賀州,542899) 2(云南省農業(yè)科學院 農產品加工研究所,云南 昆明,650200)

萵苣(Lactucasativa)又稱萵筍,是菊科一、二年生草本植物,富含豐富的蛋白質、維生素以及磷、鈣、鐵等礦物質,同時具有抗氧化、抗腫瘤等保健功能,鮮食口感爽脆,深受消費者的喜愛[1-2]。但是由于其含水量高,綠原酸、咖啡酸、類黃酮等多酚物質含量豐富[3],切割后容易引起組織代謝紊亂,發(fā)生黃化、褐變及腐爛變質,嚴重影響食用品質。

果蔬經切割處理后,發(fā)生顯著的生理生化變化,機械傷害誘發(fā)活性氧爆發(fā),破壞細胞組織正常代謝,誘導細胞膜脂過氧化,造成組織黃化、褐變[4-5]。鮮切果蔬褐變主要由酶促褐變造成,切割破壞了植物組織的細胞空間區(qū)域,使原本分布在葉綠體及其他色素體的多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)與分布在液泡內的酚類底物作用,氧化生成醌類物質,醌進一步在植物體內縮合或者與蛋白質反應,生成褐色或黑色物質[6-8]。減輕鮮切萵苣褐變有生物、物理、化學方法,主要包括氣調包裝[9]、紫外照射[10]、生物提取物[11-12]、涂膜[13]等處理。減少活性氧的積累,提高抗氧化酶活性,能有效減輕褐變的發(fā)生,也說明鮮切萵苣的褐變與活性氧代謝相關。

本研究中采用GA3處理鮮切萵苣,旨在選擇合適的處理濃度,并探討赤霉素對鮮切萵苣酶促褐變及活性氧代謝的影響,為赤霉素在鮮切果蔬中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萵苣購買于廣西賀州泰興超市;硫酸、鹽酸、巰基乙醇,西隴科學股份有限公司;過氧化氫、磷酸氫二鈉、無水乙醇、磷酸二氫鈉、硫代巴比妥酸、硫酸鈦、L-苯丙氨酸、甲硫氨酸、氯化硝基四氮唑藍(nitro-blue tetrazolium,NBT)、核黃素,廣東省化學試劑工程技術研究開發(fā)中心;三氯乙酸、丙酮、氨水,天津市大茂化學試劑廠;赤霉素,生工生物工程有限公司,以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KDC-40低速離心機,安徽中佳科學儀器有限公司;DHG—9140A電熱恒溫鼓風干燥箱,上海齊欣科學儀器有限公司;FA2004B電子天平,上海精科天美科學儀器有限公司;722 N可見分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;Centrifuge 5804R高速冷凍離心機,長沙湘銳離心機有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 處理方法

將萵苣洗凈后,去除多余的水分,用不銹鋼刀去皮切成厚度4 mm左右的圓片,挑選無病蟲害、無空心的萵苣圓片隨機分成4等份。配制GA3溶液,質量濃度分別為0、0.1、0.2、0.4 g/L,將分好的萵苣薄片于各質量濃度中浸泡3 min。晾干后裝入塑料托盤中,每個處理裝15盒,每盤裝10～12片,保鮮膜封裝后放置8 ℃培養(yǎng)箱貯藏,于0、2、4、6 d分別取樣測定生理生化指標,每個處理重復3次。

1.3.2 褐變度測定

參照帥良等[21]的方法。取5 g萵苣樣品加入10 mL 80% (體積分數(shù))乙醇研磨成均漿,在室溫下避光反應30 min,每隔5 min 攪拌1次,4 ℃下8 000 r/min離心10 min,收集上清液于420 nm處測定吸光度,以80%乙醇為空白,重復測定3次,結果以OD420表示。

1.3.3 總酚、類黃酮和醌含量測定

參考曹建康等[22]的方法。分別于280和325 nm處測定吸光值,以每 g鮮重在280 nm處的吸光值表示總酚含量,表示為OD280;每 g鮮重在325 nm處的吸光值表示類黃酮含量,即表示為OD325。

醌含量的測定參考ZHAN等[23]的方法,略有改動。

1.3.4 丙二醛含量測定

參考劉瑾等[24]的方法,略有改動。MDA含量計算公式為:

MDA含量/(μmol·g-1)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450

(1)

1.3.5 H2O2含量測定

參考LIN等[4]的方法,略有改動。用標準H2O2溶液制作標準曲線,計算樣品中H2O2的含量(μmol/g)。

1.3.6 過氧化氫酶(catalase,CAT)活性測定

參考LIN等[4]的方法,略有改動。3 mL的反應體系包括2.8 mL 15 mmol/L H2O2(0.05 mol/L pH 7.8的磷酸緩沖液配制),0.2 mL的酶液,測定1 min內OD240的變化,以1 min下降0.01為1個酶活單位,用U/(min·g)表示。

1.3.7 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性測定

參照袁芳等[5]的方法,略有改動。3 mL的反應體系包括2 mL 0.2 mol/L pH 7.8磷酸緩沖液(含0.1 mol/L EDTA),0.3 mL 220 mmol/L甲硫氨酸,0.3 mL 1.25 mmol/L NBT,0.3 mL 0.033 mmol/L核黃素,0.1 mL粗酶液。混合物光下反應20 min,560 nm處測定吸光值。1個酶活單位定義為抑制NBT光還原率50%的酶量,以U/(min·g)表示。

1.3.8 過氧化物酶(polyphenol oxidase,POD)活性測定

參考KHADEMI等[25]的方法,略有修改。3 mL反應液包括0.2% (體積分數(shù))愈創(chuàng)木酚1.9 mL,0.1% (體積分數(shù)) H2O21 mL,粗酶液0.1 mL,在470 nm處測定吸光值,以1 min增加0.01為1個酶活性單位(U),用U/(min·g)表示,每個處理重復3次。

1.3.9 多酚氧化酶活性測定

參考ZHAN等[23]的方法,略有改動。3 mL的反應液中含2.8 mL 0.2 mol/L鄰苯二酚(磷酸緩沖液配制),0.2 mL粗酶液,在398 nm下測定2 min內的吸光值,以1 min增加0.01為1個酶活力單位(U),酶活性以U/(min·g)表示,重復3次,以緩沖液為空白對照。

1.3.10 苯丙氨酸解氨酶活性測定

參照LUO等[19]的方法。取0.5 mL粗酶液,2.5 mL 0.02 mol/L的L-苯丙氨酸(37 ℃預熱15 min),混勻后反應液在37 ℃水浴保溫1 h,加入0.1 mL 6 mol/L HCl溶液終止反應,測定290 nm處的吸光值。以反應時間零為參比。以A290變化0.01為1個酶活單位(U),用U/(h·g)表示。

1.4 數(shù)據處理與分析

使用SPSS v18.0軟件進行數(shù)據處理和統(tǒng)計分析,數(shù)值以3次數(shù)據平均值±標準誤差表示,差異顯著性檢驗采用Duncan法(P<0.05),使用SPSS v18.0結合Origin 8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度GA3處理對鮮切萵苣褐變度的影響

鮮切果蔬褐變主要原因是酚類物質發(fā)生氧化反應,導致大量顏色物質積累,嚴重影響了鮮切果蔬的感官品質[6],因此褐變度是反映鮮切果蔬品質的重要指標。結果如圖1所示,隨著貯藏時間的延長,鮮切萵苣的褐變度逐漸增加。與CK相比,GA3降低了整個貯藏期的褐變度,尤其是4 d以后,褐變度顯著低于CK(P<0.05),表明GA3處理能有效抑制鮮切萵苣的褐變。劉瑾等[24]的研究也表明,赤霉素處理顯著降低貯藏期間李果實的褐變指數(shù)。本研究中,0.2 g/L處理后褐變度較0.1、0.4 g/L低,因此在后續(xù)的研究中選取0.2 g/L為試驗質量濃度。

圖1 不同濃度GA3處理對鮮切萵苣褐變度的影響Fig.1 Effects of GA3treatment at different concentrations on browning degree of fresh-cut lettuce

2.2 GA3處理對鮮切萵苣總酚、類黃酮和醌含量的影響

植物體內存在著大量酚類物質,這些酚類物質也是重要的次級代謝物,一方面它具有一定的抗氧化能力,可以修復自身傷害,另一方面作為酶促褐變反應的底物,參與酶促褐變反應[26]。圖2所示為各處理對鮮切萵苣總酚、類黃酮及醌含量的影響。

a-總酚含量;b-類黃酮含量;c-醌含量圖2 GA3處理對鮮切萵苣總酚、類黃酮和醌含量的影響Fig.2 Effects of GA3 treatment on total phenol,flavonoid content and quinone content of fresh-cut lettuce

如圖所示,CK的總酚、類黃酮、醌含量變化趨勢一致,均隨貯藏時間的延長,逐漸升高;而GA3處理后總酚和類黃酮含量呈上升趨勢,但醌含量增長趨勢較為緩慢,且GA3處理在整個貯藏期間,總酚、類黃酮和醌含量顯著低于CK(P<0.05)。綜上結果表明,GA3處理能有效減輕鮮切萵苣貯藏期間酚類物質積累,這與蔡葛平[27]的研究結果一致。

2.3 GA3處理對鮮切萵苣MDA和H2O2含量的影響

MDA和H2O2是細胞膜脂過氧化的重要產物,它的含量反映細胞膜受氧化損傷的程度[28]。過量積累MDA和H2O2破壞了細胞膜組分,導致褐變的發(fā)生[4]。如圖3-a所示,隨著貯藏時間的延長,CK 中MDA含量在前4 d逐漸增加,此后急劇上升;而GA3處理含量在前4 d增幅較小,4 d以后MDA含量顯著低于CK,第6天時MDA含量較CK低約50%。

GA3處理對鮮切萵苣H2O2含量的影響如圖3-b所示。隨著貯藏時間延長,各處理鮮切萵苣H2O2含量呈現(xiàn)先下降再升高的趨勢。GA3處理后的鮮切萵苣H2O2含量明顯低于CK,尤其是在4、6 d時,GA3處理后的H2O2含量較CK低69.7%、70.2%。與曾凱芳等[18]、LUO等[19]的研究結果一致,因此,0.2 g/L的GA3處理能顯著降低MDA和H2O2含量,減少膜脂氧化損傷,從而減輕褐變。

a-MDA含量;b-H2O2含量圖3 GA3處理對鮮切萵苣MDA和 H2O2含量的影響Fig.3 Effects of GA3 treatment on MDA and H2O2content of fresh-cut lettuce

2.4 GA3處理對鮮切萵苣SOD和CAT活性的影響

SOD和CAT是植物抗氧化防御系統(tǒng)中重要的2個抗氧化酶,SOD將·O2-轉化成H2O2,而CAT將H2O2分解成水和氧氣,從而減輕活性氧損傷[25]。如圖4-a所示,各處理SOD活性先上升,隨后活性出現(xiàn)不同程度的下降,GA3處理SOD活性低于CK,尤其在貯藏后期,顯著低于CK。與此類似,采前噴施GA3,顯著降低桃果實的SOD活性[29]。

圖4-b顯示隨著貯藏時間的延長,CAT活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,在2 d 時活性最低,GA3處理在整個貯藏期間CAT活性都高于CK。綜上結果表明,GA3處理增強了鮮切萵苣貯藏期間CAT活性,降低了SOD活性,從而促進了H2O2的分解,減少了氧化損傷。

2.5 GA3處理對鮮切萵苣POD、PPO和PAL活性的影響

PPO和POD是苯丙烷代謝途徑中的2個末端氧化酶,能將酚類物質氧化成褐色物質[29]。對于POD活性,如圖5-a所示,GA3處理與CK交互變化,在貯藏前期,GA3處理的POD活性高于CK;在貯藏中后期,CK的POD活性呈上升趨勢,顯著高于GA3處理,而GA3處理的活性在4 d后下降趨勢較平緩。POD在植物中有雙重作用,既可以作為抗氧化酶清除H2O2,減少活性氧積累,又能催化酚類物質氧化,引起褐變。GA3處理前期POD活性升高可能主要用于分解H2O2,從而引起2 d時H2O2含量較低(圖3-b)。

a-SOD活性;b-CAT活性圖4 GA3處理對鮮切萵苣SOD和CAT活性的影響Fig.4 Effects of GA3 treatment on CAT and SOD activity of fresh-cut lettuce

由圖5-b可知,CK的PPO活性在整個貯藏期間一直呈上升趨勢,而GA3處理的PPO活性呈波動變化,但CK始終高于GA3處理,尤其是在儲藏第4 天,CK比GA3處理高32.89%。PPO和POD活性的變化情況表明GA3處理減輕了鮮切萵苣褐變程度。

a-POD活性;b-PPO活性;c-PAL活性圖5 GA3處理對鮮切萵苣POD、PPO和PAL 活性的影響Fig.5 Effects of GA3 treatment on POD,PPO and PAL activity of fresh-cut lettuce

由圖5-c可知,隨著貯藏時間的延長,PAL活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;除了第4 天外,其他時間CK的PAL活性均高于GA3處理。PAL是苯丙烷代謝途徑上的關鍵酶[29],主要負責酚類物質的生物合成。本研究表明GA3處理能有效抑制PAL活性,減少酚類物質的產生。PAL、PPO和POD是鮮切果蔬酶促褐變過程中重要的酶,抑制這些酶的作用,能有效抑制褐變的發(fā)生[6,23]。綜上結果表明,GA3處理能有效抑制PAL、PPO和POD活性,從而抑制鮮切萵苣發(fā)生酶促褐變,這些結果與酚類物質的變化趨勢一致。

3 結論

本研究采用不同濃度的GA3處理鮮切萵苣,發(fā)現(xiàn)0.2 g/L的GA3能顯著降低萵苣的褐變度,維持鮮切萵苣的品質。0.2 g/L GA3顯著抑制了鮮切萵苣貯藏期間MDA、H2O2含量的增加,抑制了酚類物質、類黃酮以及醌類物質等色素的積累,抑制了PAL、PPO、POD和SOD活性,提高了CAT活性,減輕了活性氧的積累,從而延緩鮮切萵苣的褐變,保證了鮮切果蔬貯藏期間的品質。