超聲波預處理結合控溫控濕發酵對黑蒜色變及風味品質的影響

王浩宇,劉肖,2,趙珠蓮,周才瓊,3*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715) 2(川北幼兒師范高等專科學校,四川 廣元,628017) 3(重慶市特色食品工程技術研究中心,重慶,400715)

大蒜(AlliumsativumL.)是一種廣泛使用的藥食兩用物質,既是“天然抗生素”,又是重要的調味料。但大蒜較強的辛辣味和刺激性影響其接受度,加上水分含量高,不耐貯藏,屬半易腐物質[1],因此,大蒜及深加工備受關注。常見的大蒜加工產品有糖蒜、臘八蒜、蒜泥、蒜片和蒜粉等[2-3],近年受關注的有作為保健食品開發的大蒜素以及發酵加工產品如黑蒜[4-5]。

黑蒜是興起于21世紀初的一種以大蒜為原料、經控溫控濕發酵加工黑變并可直接食用的健康食品[6]。由于發酵期間各滋味成分含量及組成發生改變,獲得了較為適當的酸甜味感,揮發性風味物質中刺激味含硫化合物如二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚含量減少[7],噻吩、呋喃等香氣化合物增加[8],整體口感黏彈軟糯似果脯,在日本、韓國、泰國較為流行[9]。近年來,進入我國市場。傳統黑蒜主要采用高溫高濕發酵[10],制作周期長達3個月,能耗較高。有少量通過改進工藝技術來縮短黑蒜發酵時間的研究報道,如采用三段式變溫發酵法[11]、低溫冷凍預處理結合變溫發酵法[12]、微波預處理[13]、高壓預處理[14],以及將蒜瓣破碎后采用液態發酵的方法[15]等,發酵時間縮短到15～30 d,但這些方法發酵時間仍然較長,有的工藝較為復雜,或采用粉碎發酵影響產品應用。采用預處理是縮短黑蒜發酵時間的重要手段,一定的預處理可使大蒜細胞組織結構破壞,促進美拉德反應,加快發酵黑變速度以縮短發酵工藝周期、降低能源消耗。

超聲波作為一種新食品加工技術可通過空穴效應導致細胞結構破壞,釋放細胞內活性物質,從而加速食品化學變化以形成特有風味[16],具有易操作,低成本和環境友好等優點[17],已被廣泛用于食品領域[18]。本研究通過對大蒜采用超聲波預處理后進行控溫控濕發酵,探討黑蒜發酵中色變及風味品質變化,以期進一步縮短黑蒜發酵時間和簡化工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

大蒜,巫山紫紅天蒜股份合作聯合社。

1.2 主要試劑

硼酸、CuSO4、K2SO4、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、甲基紅、溴甲酚綠、亞甲基藍、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、茚三酮、沒食子酸、焦性沒食子酸,成都市科龍化工試劑廠;丙酮酸、2,4-二硝基苯肼、三氯乙酸、福林酚試劑、冰乙酸,重慶駿偉廣生科技有限公司;5-羥甲基糠醛試劑、對甲基苯胺、巴比妥酸、亮氨酸、高錳酸鉀、乙酸鈉、乙二醇、亮氨酸、異丙醇、抗壞血酸,重慶川東化工試劑廠。以上試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

GCMS-2010氣相質譜聯用儀、UV-2450紫外-可見分光光度計,日本島津公司;KQ-500DE數控超聲器,昆山超聲儀器有限公司;TG16G離心機,常州崢嶸儀器有限公司;Ultra Scan PRO測色儀,美國HunterLab公司;SH010恒溫恒濕試驗箱,上海福絮實驗室儀器設備廠。

1.4 實驗方法

1.4.1 超聲波預處理及黑蒜制備

超聲波預處理:取新鮮蒜頭500 g,以PVDC膜包裹后置超聲器中,以預處理后蒜瓣色變為基礎,通過預實驗確定超聲波頻率40 kHz,超聲功率300 W,40 ℃處理30 min,然后置于40 ℃,相對濕度80%條件下放置平衡48 h。

黑蒜發酵:設計發酵相對濕度(70%、80%、90%)和發酵溫度(70、75、80 ℃)進行2項分組全因素發酵工藝實驗,每3 d取樣分析,直至蒜瓣完成黑變。

1.4.2 分析方法

(1)色值[19]:選擇大小相近的去外皮蒜瓣經充分研磨后進行分析。以標準白板校準,測量時分別記錄L*、a*和b*值為所測樣品亮度、紅度和黃度值,L(明度)軸,0代表黑,100代表白;a(紅-綠)軸,正值為紅,負值為綠,0為中性色;b(藍-黃)軸,正值為黃,負值為藍,0為中性色重復測定6次。總色差值以dE*表示,按公式(1)計算:

(1)

式中:dL*、da*和db*表示處理后蒜瓣色值;L*,a*,b*表示處理前蒜瓣色值。

(2)游離氨基酸總量:參考文獻[20]并稍作修改。稱取1.0 g樣品加入5.0 mL體積分數10%乙酸溶液進行研磨勻漿,轉移至100 mL容量瓶用蒸餾水定容,濾紙過濾后,取0.25 mL樣品濾液,置于20 mL干燥的具塞試管中,加入1 mL無氨蒸餾水、3 mL水合茚三酮試劑和0.1 mL 1 g/L抗壞血酸溶液后混勻,于100 ℃水浴5 min,冷卻,迅速加入5 mL體積分數95%乙醇,蓋好塞子振蕩試管,溶液呈藍紫色時用體積分數60%乙醇稀釋至20 mL,在波長570 nm處測定吸光值,再根據標準曲線(y=0.050 9x-0.048 9,R2=0.999 6)計算樣品中游離氨基酸的總量。

(3)其他指標:水分含量按照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中直接干燥法;總酸按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》進行測定;可溶性糖按照NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的測定 3,5-二硝基水楊酸比色法》進行測定;5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,5-HMF)參考安東[11]的方法稍作修改;大蒜素參考朱君芳[21]方法稍作修改。

(4)揮發性成分:參照潘璨等[22]的方法并稍作修改。

①揮發性成分萃取:樣品去皮破碎后,精確稱取2 g置于20 mL頂空進樣瓶,50 ℃下水浴平衡30 min后,推出SPME萃取頭,50 ℃下水浴萃取30 min,開始進樣分析。

②GC-MS條件:鮮蒜及預處理大蒜色譜條件:DB-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)石英毛細管色譜柱,進樣口溫度250 ℃;載氣(He)流速1 mL/min,不分流;進樣量2 mL。升溫程序:初始50 ℃,維持1 min后以3 ℃/min 的升溫速率使溫度上升到75 ℃,維持1 min后以1 ℃/min的速率上升至110 ℃,維持3 min后,再以2 ℃/min的速率上升至150 ℃,維持2 min,最后以10 ℃/min的速率使溫度上升至280 ℃,維持3 min。

黑蒜色譜條件:柱型、進樣口設置溫度、載氣流速、進樣量皆同上,起始柱溫50 ℃,維持2 min后,以1 ℃/min的升溫速率將溫度升至75 ℃并維持1 min,然后以10 ℃/min升至90 ℃,維持1 min,再以3 ℃/min升至210 ℃,最后以10 ℃/min升至280 ℃,維持1 min。

質譜條件:電子轟擊電離源,電子轟擊能量,70 eV,離子源溫度250 ℃,接口溫度280 ℃,質量掃描范圍50～500 amu。

③數據分析:

定性分析:通過NIST08和NIST08S質譜數據庫檢索各組分,結合保留指數和人工質譜解析及參考文獻等方法共同確定。

定量分析:按照峰面積歸一法計算各組分相對含量。

1.4.3 發酵黑蒜的模糊數學感官評價

參考文獻[23]的方法，建立感官評價小組、評價術語(表1)、評判對象因素集、權重集、評語集、單因素評判模糊矩陣，對樣品進行綜合評價，得到各個黑蒜樣品的綜合得分。

1.5 數據處理

結果以平均值±標準差表示,采用Origin 2018作圖,SPSS 20.0進行單因素方差分析、Pearson相關性分析和主成分分析。P<0.01表示極顯著,P<0.05表示顯著。

2 結果與分析

2.1 黑蒜發酵過程中感官品質的變化

2.1.1 黑蒜發酵過程中水分含量變化

如表2所示,在相對濕度為70%～80%下隨發酵溫度升高,大蒜含水量在前期快速下降(P<0.05),多數處理在9 d后保持穩定,含水量在(31.96±6.29)%;相對濕度為 90%條件下發酵,隨處理溫度升高含水量升高,高于鮮蒜(65.88%)。75和80 ℃處理隨發酵時間延長含水量升高,相對濕度為 90%條件下發酵9～15 d時含水量在57.30%～81.44%波動。這可能與高溫高濕下蒸汽更易進入蒜瓣有關,此時可觀察到大蒜發軟,部分軟爛,表明相對濕度為 90%太高,不宜作為發酵濕度條件。后續發酵相關指標分析只考慮相對濕度為 70%～80%的處理。

表2 含水量在黑蒜發酵過程中的變化 單位：%

2.1.2 黑蒜發酵過程中色澤的變化

5-HMF是 Maillard 反應重要的中間產物,也是色素沉積的潛在條件[24],5-HMF是黑蒜的呈色物質之一[25]。5-HMF在發酵中的變化實驗結果如圖1所示,5-HMF隨發酵時間延長逐漸升高,6 d后快速上升(P<0.05),在相同相對濕度條件下隨處理溫度升高而升高,表明在本發酵濕度范圍升高發酵溫度可加速大蒜黑變。有報道5-HMF含量隨溫度和時間變化的函數關系符合一級反應動力學方程[26],高溫下5-HMF含量隨溫度的升高呈指數增長趨勢,本實驗結果與之相符。

a-相對濕度70%; b-相對濕度80%圖1 5-HMF在黑蒜發酵過程中的變化Fig.1 Changes of 5-HMF in black garlic fermentation

色值在發酵中的變化實驗結果見圖2。在相同相對濕度條件下,隨發酵溫度升高色變增大,隨發酵時間延長色值快速升高后保持穩定(P<0.05)。色值對應蒜瓣色澤見圖3,相對濕度為70%,75 ℃發酵3 d時的色值56.93,此時蒜瓣呈棕褐色(圖3-a),發酵到6 d時,蒜瓣呈棕黑色,此時色值66.84(圖3-b);在相對濕度為70%,70 ℃發酵12 d時的色值71.73,此時蒜瓣呈黑色(圖3-c),相對濕度為70%,80 ℃發酵9 d時的色值81.96(圖3-d),發現色值>70可判斷黑蒜發酵黑變完成。本實驗中,發酵6 d時各處理的色值在49.03～72.91,呈棕褐到棕黑色;以色變>70完成黑變為限值(圖2),相對濕度為70%時發酵9 d各處理溫度均完成黑變,相對濕度為80%發酵15 d均完成黑變,即低相對濕度和較高的發酵溫度更利于發酵黑變,與前述5-HMF變化不一致,表明發酵黑變可能還受其他因素如維生素C和酚類物質等氧化褐變的影響。

a-相對濕度70%; b-相對濕度80%圖2 色值在黑蒜發酵過程中的變化Fig.2 Changes of color value during black garlic fermentation

a-相對濕度為70%,75 ℃發酵3 d;b-相對濕度為70%,75 ℃發酵6 d;c-相對濕度為70%,70 ℃發酵12 d;d-相對濕度為70%,80 ℃發酵9 d圖3 黑蒜發酵中的色值變化及對應色澤Fig.3 Change of color value and corresponding color in black garlic fermentation

2.2 黑蒜發酵中滋味品質成分的變化

2.2.1 可溶性糖含量的變化

可溶性糖含量隨發酵時間延長快速增加(P<0.05)后下降,峰值在發酵9 d左右,此時甜味感最強(圖4)。這種變化的可能原因是大蒜含水量不斷下降,其次是大蒜總糖在發酵過程中的降解,后期下降可能與美拉德反應的消耗有關。不同相對濕度均以75 ℃下發酵時可溶性糖保持較高水平,發酵9～12 d時含量波動在41.02%～44.06%。

a-相對濕度70%; b-相對濕度80%圖4 發酵黑蒜的可溶性糖含量變化Fig.4 Changes in soluble sugar content of fermented black garlic

2.2.2 總酸含量的變化

總酸含量隨發酵時間延長顯著升高(P<0.05)(圖5),表明延長發酵時間會使黑蒜產品酸味增強。相對濕度為70%下發酵,總酸含量隨發酵溫度升高而升高,在相對濕度為80%下發酵6 d后則以75 ℃處理最高;表明高溫低濕發酵會增強黑蒜產品酸味感。

a-相對濕度70%; b-相對濕度80%圖5 黑蒜發酵中總酸含量的變化Fig.5 Changes of total acid content of black garlic in fermentation

2.2.3 游離氨基酸含量的變化

如圖6,游離氨基酸含量隨發酵時間延長呈先增后降趨勢,這可能與蛋白質在濕熱作用下水解生成氨基酸以及參與美拉德反應逐漸消耗有關。峰值多出現在第9 天,相對濕度為70%和80%時游離氨基酸峰值含量分別在0.74%～1.10%濕基和0.52%～0.58%濕基,說明較低濕度有利于游離氨基酸的積累。延長發酵時間不利于黑蒜鮮味品質特征。

a-相對濕度70%; b-相對濕度80%圖6 發酵黑蒜游離氨基酸含量的變化Fig.6 Changes of free amino acid content in fermented black garlic

2.2.4 大蒜素含量的變化

如圖7,大蒜素含量隨發酵時間延長呈下降趨勢。在相同相對濕度下,隨發酵溫度升高,大蒜素含量降低,其中相對濕度為80%時大蒜素含量水平總體低于相對濕度為70%;大蒜素含量適度下降有利于降低黑蒜產品的辛辣刺激性和苦味感[27]。

a-相對濕度70%; b-相對濕度80%圖7 發酵黑蒜大蒜素含量的變化(%濕基)Fig.7 Changes of allicin content of black garlic in fermentation(% wet basis)

2.3 發酵黑蒜感官品質評價及發酵工藝選擇

對前述不同相對濕度和溫度的條件發酵6～15 d,合計24個樣品采用模糊數學感官評價綜合評判(圖8)。8分以上9個樣品,分值在8.00～8.45,含水量27.20%～44.95%(中值34.64%),可溶性糖30.87%～44.06%,游離氨基酸0.213%～0.798%,大蒜素含量0.045%～0.134%,這種波動表明感官品質受多種因素影響。

a-相對濕度70%; b-相對濕度80%圖8 不同發酵時段黑蒜模糊數學綜合感官評價得分圖Fig.8 Fuzzy mathematics comprehensive sensory evaluation score chart of black garlic in different fermentation periods

從發酵時間看,發酵12 d分值在8.00～8.21的有4個樣品,分別是相對濕度80%、75 ℃和相對濕度70%下溫度在70～80 ℃,說明相對濕度為70%較好;發酵9 d受歡迎的有4個樣品,分別是相對濕度為70%、75或80 ℃,或相對濕度為80%、75或80 ℃。兼顧品質和效率,選擇相對濕度為70%、75 ℃下發酵9 d為發酵優化條件。

2.4 揮發性風味物質在黑蒜發酵中的變化

分析鮮蒜(FG)、超聲波預處理大蒜(UG)和優化發酵工藝制備黑蒜(UBG)的揮發性風味物質變化,共檢出31種揮發性物質。FG、UG和UBG分別檢出19、19和17種揮發性物質;FG、UG以具有辛辣和蒜香風味的硫醚類為主,分別檢出8種和7種,相對含量分別占75.78%和81.25%,以具有辛辣刺激的蒜香味的二烯丙基二硫醚占比最高,制備成黑蒜后,二烯丙基二硫醚占比有所下降,具有蒜香味的二烯丙基硫醚從原料的1.56%增加至43.44%,使黑蒜辛辣刺激性下降,同時具有洋蔥和碳烤風味的噻烷類增加,還產生了具有蒜香和肉香味的2-乙基-1,3-噻唑烷-4-羧酸鹽(表3)。

表3 超聲波預處理及發酵黑蒜的揮發性成分種類及含量比較Table 3 Comparison of the types and contents of volatile components in ultrasonic pretreatment and fermented black garlic

2.4.1 揮發性物質的主成分分析

對樣品中硫醚類、噻吩類、烷類、酯類、酸類及其他類揮發性物質相對含量進行主成分分析,得到各主成分的特征值、方差貢獻率、累計方差貢獻率,見表4,特征根λ1=3.835,特征根λ2=2.165,前2個主成分累計方差貢獻率達100%,即涵蓋了全部信息。

揮發性物質載荷分析如圖9,相對含量最高的硫醚類風味物質與PC1高度正相關(載荷系數>0.8),其他含硫化合物為PC1中載荷最高的正相關揮發性物質(載荷系數>0.8),而酸類及烷類與PC1高度負相關(載荷系數<-0.8);PC2中載荷最高的正相關揮發性物質為噻吩類(載荷系數>0.8)。上述結果說明硫醚類、其他含硫化合物、酸類、烷類及噻吩類是FG、UG、UBG中含量發生顯著變化的揮發性物質。

表4 主成分特征根和貢獻率Table 4 Principal component characteristic root and contribution rate

圖9 樣品中揮發性物質的載荷分析圖Fig.9 Looding plot of volatile substances in samples

樣品得分如圖10,FG、UG、UBG位于圖中3個象限,表明它們之間有較大差異。UG及FG位于PC1中正半軸,在PC1中兩者間差異不大;UBG位于PC1中負半軸,與UG、FG間有顯著差異,具體體現在硫醚類、其他硫化合物、酸類及烷類揮發性物質的不同。在PC2中,UG與UBG位于正半軸,兩者間差異體現在噻吩類揮發性物質的不同;FG位于負半軸,與UBG的差異體現在酯類揮發性物質的不同,與UG的差異體現在噻吩類揮發性物質的不同。

圖10 樣品的得分圖Fig.10 Scoring plot of samples

具體看,UBG中,硫醚類占主導,相對含量最高的為二烯丙基硫醚(43.44%),較FG有極顯著增加;相對含量次高的為二烯丙基二硫醚(26.89%),較FG有明顯下降;其余硫醚類相對含量均較FG有明顯降低。FG中3-乙烯基-4-烯-1,2-環己硫醚、二戊基二硫醚、3-乙烯基-5-烯-1,2-環己硫醚、烯丙基甲基二硫醚均未在UBG中檢出,硫醚類物質種類較鮮蒜時減少,推測高溫高濕發酵使FG中硫醚類化合物斷裂和重排,引起各組分間相對含量變化,使黑蒜產品刺激性氣味顯著降低。黑蒜中增加較多的還有具蒜香和肉香味的2-乙基-1,3-噻唑烷-4-羧酸鹽(9.63%)和1,3,5-三噻烷(5.66%),加上其他揮發性香氣物質,共同構成了黑蒜特殊香氣。

2.4.2 揮發性物質歸類及氣味貢獻值分析

經對揮發性物質氣味種類進行歸類(圖11),與FG、UG相比,UBG中新產生出果香甜味及酒香味物質,味道較濃郁的洋蔥味與橡膠味的物質種類減少,呈刺激辛辣味的物質種類較FG與UG明顯減少。

圖11 揮發性物質的氣味類型Fig.11 Odor types of volatile substances

查閱風味成分氣味閾值并計算其氣味貢獻值(表5),顯示從鮮蒜到黑蒜產品,具有刺激蒜味和硫磺味的二烯丙基三硫醚氣味貢獻下降,而具有辛辣刺激蒜香味的二烯丙基二硫醚、具有蒜香味的二烯丙基硫醚、蒜香和碳烤香味的1,3-二噻烷和2-甲基-1,3-二噻烷氣味貢獻度增加,還增加了具有果香甜味的丁酸苯乙酯和2-乙酰基呋喃。這些變化使黑蒜產品蒜香味突出,刺激及辛辣味明顯降低,同時還有微弱的果香味、碳烤香味。

表5 主要揮發性物質的氣味值及其風味描述Table 5 Odor value and flavor description of main volatile substances in black garlic

3 結論

含水量是黑蒜質感最重要指標,在相對濕度為90%條件下發酵蒜瓣含水量升高可導致大蒜發軟,部分軟爛,不宜作為發酵濕度條件。黑變是黑蒜最重要感官品質指標,提高溫度可加快黑變,但高相對濕度為不利于黑變,結合蒜瓣感官色澤觀察,色值>70可判斷發酵黑變完成。

滋味成分分析顯示,延長發酵時間和提高發酵溫度均可提高黑蒜產品酸味感并降低甜鮮味感和辛辣刺激的苦味感。經模糊數學感官評價得到優化后的發酵工藝:相對濕度為70%,75 ℃下發酵9 d。以鮮蒜和超聲預處理蒜瓣為對照,研究該最佳工藝發酵黑蒜揮發性風味品質特點,顯示鮮蒜和蒜瓣以具有辛辣蒜味的硫醚類為主,制備成黑蒜后,具有辛辣刺激蒜味的二烯丙基二硫醚占比下降,具有蒜香味的二烯丙基硫醚增加,具有洋蔥和碳烤風味的噻烷類增加,還產生了具有蒜香和肉香味的2-乙基-1,3-噻唑烷-4-羧酸鹽。主成分分析和氣味貢獻值分析進一步確定了黑蒜產品特征香氣為蒜香味,有碳烤和肉香味和微弱的果香味。