不同菌株組成飲用型酸奶發(fā)酵劑指紋圖譜的構(gòu)建

楊菲菲,麻志寧,王祎,李紅娟,李洪波,于景華*,王妙姝,康紅艷

1(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津,300457) 2(北京三元食品股份有限公司,北京,101107) 3(河北新希望天香乳業(yè)有限公司,河北 保定,071000)

飲用型酸奶主要以鮮牛乳為原料,殺菌后接種嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌,凝固成型后破乳均質(zhì)而制成[1]。酸奶獨特的香氣是人們鑒別它的重要方式[2]。酸奶中的揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量和種類決定了酸奶的風(fēng)味品質(zhì)[3]。其中大約有100多種揮發(fā)性物質(zhì)被鑒定出來,包括酮類、醛類、酯類、酸類和其他[4]。這些物質(zhì)由乳脂的分解以及乳糖、檸檬酸鹽的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生[5],形成了酸奶獨特的味覺體驗。

不同菌種發(fā)酵成的酸奶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)不同。典型飲用型酸奶風(fēng)味形成的基本揮發(fā)性成分是乙醛、丙酮、2-丁酮、乙二酰、乙酸乙酯和乙醇[6]。王琴等[7]報道,復(fù)配菌株的生成風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量普遍高于單菌株的平均水平。嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的的互利共生作用已被廣泛認(rèn)可?？茲h森、丹尼斯克、多愛特品牌推出球菌占絕對優(yōu)勢的直投式發(fā)酵劑在中國市場得到廣泛應(yīng)用。

頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(headspace solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME/GC-MS)被廣泛用于揮發(fā)性化合物的測定,能有效對食物樣品中揮發(fā)性化合物進行分析鑒定[8]。食品指紋圖譜利用食品的特有品質(zhì)達(dá)到區(qū)分鑒別的目的,這個過程中包含特定的數(shù)值轉(zhuǎn)換處理。香氣指紋圖譜主要采用對樣品中的各種風(fēng)味化合物提取,分析其組成和含量,從而建立該產(chǎn)品的共有模式體系[9]。

目前,國內(nèi)外學(xué)者對酸奶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)研究集中在不同地域酸奶的風(fēng)味物質(zhì)比較[10],或者是一種菌的不同菌株產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)[11],也包括在發(fā)酵的不同階段所產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)[12]。但是,很少有研究通過酸奶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)建立飲用型酸奶的香氣指紋圖譜。本研究探究了10種商業(yè)發(fā)酵劑飲用型酸奶的揮發(fā)性風(fēng)味成分,對發(fā)酵劑菌種為嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的飲用型酸奶進行HS-SPME/GC-MS分析,構(gòu)建飲用型酸奶的指紋圖譜。采用主成分分析分析10種飲用型酸奶的14種特征性風(fēng)味物質(zhì),為酸奶的品質(zhì)評價及質(zhì)量控制提供參考標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛乳,滄州市牛奶廠;白砂糖,河北古松農(nóng)副產(chǎn)品有限公司;果膠,內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司;稀奶油,山東君君乳酪有限公司;乳清蛋白粉(WPC8200),天津銀河偉業(yè)進出口有限公司;10種發(fā)酵劑:科漢森903、科漢森904、科漢森Mild1.0,科漢森有限公司(以下簡稱品牌一);丹尼斯克863、505、883,丹尼斯克有限公司(以下簡稱品牌二);多愛特JOINTEC D、多愛特VH349、多愛特JOINTEC Y14、多愛特 JOINTEC VB539,北京多愛特生物科技有限公司(以下簡稱品牌三),依次編號為A1～A10。

1.2 儀器和設(shè)備

GCMS-QP2010型島津氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,日本Shimadzu 公司;57348-U型手動 SPME 進樣器、DVB/CAR/PDMS萃取頭(50/30 μm),帶有硅膠墊帽的萃取瓶(15 mL),美國Supelco公司;DB-WAX型毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),美國Agilent公司;JR-2型集熱式磁力加熱攪拌器,天津市歐諾儀器儀表有限公司;YXQ-LS-50SⅡ型立式壓力蒸氣滅菌器,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;TW-Basic高壓均質(zhì)機,上海沃迪公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的制備

商業(yè)發(fā)酵劑制備飲用型酸奶樣品的流程:

原料乳→添加配料→共同升溫至(50±2) ℃→定容均質(zhì)→殺菌(95 ℃、5 min)→冷卻(41～42 ℃)→接種→發(fā)酵5.5～7.5 h →冷卻(9～13 ℃)→攪拌、均質(zhì)→灌裝→后熟(4 ℃、12 h)→冷藏

實驗前將要用到的玻璃儀器在121 ℃、15 min下高壓蒸氣滅菌。配料過程包括:先稱取白砂糖與果膠、瓊脂、拌勻,用少量溫水進行溶解,然后水合30 min,再將剩余白砂糖、乳清濃縮蛋白粉、稀奶油、混勻,用熱水溶解水合30 min。水合結(jié)束后,將2種配料混合再加入原料乳定容。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定分析

HS-SPME條件:將萃取頭在氣相色譜260 ℃老化30 min,用50/30 μm CAR/DVB/PDMS萃取頭對揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分進行萃取。酸奶5 g放于15 mL頂空進樣瓶,加入NaCl封蓋。放到磁力恒溫攪拌器中。吸附溫度選擇45 ℃。萃取時間選擇45 min。選擇磁力攪拌的方式進行樣品攪動,攪拌使用磁力攪拌器進行樣品攪拌。轉(zhuǎn)速選擇800 r/min,每5 g酸奶加入1.2 g NaCl。

GC條件:采用程序升溫方式,起始溫度為40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min升溫到180 ℃,保持1 min,7 ℃/min升溫到250 ℃,保持5 min;進樣口溫度:250 ℃,傳輸線230 ℃;載氣為He,流速2.0 mL/min;不分流進樣。

MS條件:離子源溫度為220 ℃,接口溫度220 ℃。電離方式為EI,電子能量70 eV;掃描范圍30.00～500.00 u。發(fā)射電流100 μA,檢測電壓1.4 kV。

定性和定量分析:利用隨機攜帶Masshunter 工作站NIST 11標(biāo)準(zhǔn)庫進行搜索,查找有關(guān)質(zhì)譜資料,分別對各峰所代表的風(fēng)味化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和名稱加以確認(rèn)。利用面積歸一化法計算各組分峰面積百分比(相對含量)。

1.4 指紋圖譜相似度計算

采用夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法分析發(fā)酵乳樣品氣味指紋圖譜間的相似性,該算法能夠反映和識別復(fù)雜風(fēng)味成分在化學(xué)組成與含量比例上的相似性。夾角按公式(1)[13]計算:

(1)

式中:Xik,第i個樣品的第k個特征變量；Xrk,特征指紋圖譜的第k個特征變量。

相關(guān)系數(shù)相似度如公式(2)所示:

(2)

1.5 統(tǒng)計分析

采用Origin 9.0軟件建立GC-MS指紋圖譜及進行主成分分析。數(shù)據(jù)處理和顯著性分析使用SPSS 23.0,實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析分析組間差異,以P<0.05表示差異顯著。所有實驗重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS結(jié)果分析

10種酸奶樣品HS-SPME/GC-MS檢測結(jié)果如表1所示。10種飲用型酸奶的風(fēng)味成分種類無明顯差別,能保證酸奶的整體風(fēng)味,但各類物質(zhì)的含量及呈味閾值差距很大,使得10種酸奶呈現(xiàn)不同的風(fēng)味特征。

10種酸奶中共檢測出61種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),包括醛類9種、酮類11種、酸類7種、酯類11種、醇類15種、芳香族及烷烴化合物8種。酮類物質(zhì)是酸奶風(fēng)味物質(zhì)中占比較多的化合物,對酸奶風(fēng)味的貢獻具有重要作用[14]。A1～A10酸奶樣品中的酮類物質(zhì)大部分由雙乙酰、2-庚酮、3-羥基-2-丁酮、2-壬酮組成。雙乙酰呈現(xiàn)甜香、奶油味[15],2-庚酮呈現(xiàn)腐臭、奶酪味[15],3-羥基-2-丁酮呈現(xiàn)黃油味[15],2-壬酮帶有奶油、果香味[16]。實驗測得3-羥基-2-丁酮含量是所有風(fēng)味物質(zhì)中最高的,與前人的研究[17]相符。雖然其含量高,但是對酸奶風(fēng)味的影響卻不如雙乙酰[18]。醛類的風(fēng)味閾值一般很低,對整體風(fēng)味貢獻大,是各種氧化風(fēng)味的來源[19]。乙醛、壬醛和癸醛對酸奶樣品的風(fēng)味物質(zhì)貢獻較大,乙醛呈現(xiàn)芳香味[14],壬醛呈現(xiàn)蠟香、脂肪香[16]。醇類化合物雖然種數(shù)較多,但其風(fēng)味閾值高,對酸奶的風(fēng)味貢獻度不大[20]。醇類物質(zhì)中2-乙基己醇和正辛醇含量相對較高,2-乙基已醇具有甜味和花香[16]。揮發(fā)性酸類物質(zhì)是由乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生,酸味物質(zhì)中含量較高的是乙酸、丁酸、己酸、辛酸,乙酸帶有辛辣的酸味[15],丁酸呈現(xiàn)腐臭的、汗臭的[15],己酸則是辛辣的、有花香的[16]。辛酸在10種酸奶中的含量無顯著性差異。酯類化合物在酸奶中的風(fēng)味感知較高,對酸奶風(fēng)味形成的作用也很大[21]。酯類物質(zhì)中己二酸二辛酯占優(yōu)勢,己二酸二辛酯帶有水果香氣和甜味[14]。

酸奶的風(fēng)味協(xié)調(diào)性與雙乙酰和乙醛的比例有較大關(guān)系。華朝麗等[22]認(rèn)為,當(dāng)雙乙酰:乙醛在3.0～4.5時,酸奶呈現(xiàn)協(xié)調(diào)的芳香味。A1～A10的雙乙酰:乙醛在0.90～4.37,而A5酸奶是唯一一組雙乙酰:乙醛<1的酸奶樣品,可能與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在整體發(fā)酵劑的占比有關(guān)。乙醛和雙乙酰一直被認(rèn)為是酸奶中的重要風(fēng)味成分[23]。盡管目前的分析設(shè)備能夠檢測出許多揮發(fā)性化合物,但只有少數(shù)揮發(fā)性化合物的濃度足夠高,足以對酸奶的感官特性起到至關(guān)重要的作用[1]。乙醛更多地被認(rèn)為由保加利亞乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生,而雙乙酰由嗜熱鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)生[24]。10種商業(yè)發(fā)酵劑的菌種組成不同,例如多愛特品牌JOINTEC D由95%的嗜熱鏈球菌和5%的保加利亞乳桿菌組成,產(chǎn)酸速度適中,酸奶在貨架期內(nèi)具有溫和的風(fēng)味。

2.2 指紋圖譜的建立

2.2.1 參考峰的確定

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)建立指紋圖譜,構(gòu)建飲用型酸奶指紋圖譜[25]。由于發(fā)酵乳是一個類似中藥的復(fù)雜體系,所以應(yīng)用指紋圖譜技術(shù)可以全面反映發(fā)酵乳中風(fēng)味化合物的種類和數(shù)量,評價發(fā)酵乳的品質(zhì)。選擇1個保留時間在15.7 min左右的色譜峰,且該峰位于色譜圖中靠近中心的位置,峰的強度較高,分離度較好,同時是10種樣品共同擁有的物質(zhì),將此峰作為參考峰。經(jīng)過GC-MS分析可知,此峰為乙酸。乙酸的相對保留時間和相對峰面積分別為1和100。

2.2.2 特征風(fēng)味指紋圖譜的構(gòu)建

選定參考峰后計算所有色譜圖中其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對峰面積和相對保留時間,最后選擇相對峰面積Sr>1%的共有峰[26],以各共有峰的集合作為樣品的特征指紋峰。將所得的共有峰相對峰面積進行平均,得出標(biāo)準(zhǔn)圖譜,作為特征指紋圖譜。

10種不同發(fā)酵劑酸奶繪制的重疊色譜圖如圖1所示,飲用型酸奶特征風(fēng)味指紋圖譜信息如表2所示。10種不同商業(yè)發(fā)酵劑所制酸奶中揮發(fā)性化合物相對峰面積>1%的共有峰有14種,可將其視為酸奶的特征風(fēng)味物質(zhì)。14種特征風(fēng)味物質(zhì)中包括3種醛、4種酮、4種酸、2種醇及1種酯類。即乙醛、雙乙酰、2-庚酮、3-羥基-2-丁酮、2-壬酮、壬醛、乙酸、2-乙基己醇、癸醛、正辛醇、丁酸、己酸、辛酸、己二酸二辛酯。

圖1 10種商業(yè)發(fā)酵劑酸奶特征風(fēng)味指紋圖譜Fig.1 Characteristic flavor fingerprints of yogurt fermented by 10 commercial starter cultures

表2 飲用型酸奶特征風(fēng)味指紋圖譜信息Table 2 The information on characteristic flavour fingerprints of drinking yogurt

2.3 發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析

取10種酸奶樣品進行主成分分析,樣品點與14種特征風(fēng)味物質(zhì)在主成分載荷圖上越接近,兩者的相關(guān)性越高。14種特征風(fēng)味物質(zhì)的主成分載荷圖如圖2所示。

圖2 14種特征風(fēng)味物質(zhì)的主成分載荷圖Fig.2 Principal component loading diagrams of 14 characteristic flavor substances

從圖2可知,A1、A2、A3和A4酸奶的發(fā)酵風(fēng)味與2-庚酮、壬醛、2-乙基已醇等風(fēng)味物質(zhì)有較強的相關(guān)性,A5酸奶的發(fā)酵風(fēng)味與2-壬酮、乙醛、乙酸、癸醛有較強的相關(guān)性,A6、A7、A8、A9、A10酸奶的發(fā)酵風(fēng)味與丁酸、己酸、己二酸二辛酯具有較強的相關(guān)性。先前的研究認(rèn)為癸醛對整體風(fēng)味有重要修飾作用而不是關(guān)鍵性作用,這主要是因為關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)在發(fā)酵及貯藏各階段呈不斷變化狀態(tài),使發(fā)酵乳呈現(xiàn)出不同的風(fēng)味特征[27]。主成分得分圖的4個象限將品牌一和品牌三也有很好的區(qū)分,而品牌二3個樣品在圖2中分布零散,說明品牌一和品牌三所選樣品具有更高的整體性。

2.4 酸奶指紋圖譜構(gòu)建方法的驗證

在指紋圖譜的構(gòu)建過程中,為保證特征香氣指紋信息的準(zhǔn)確度,需要對指紋圖譜的構(gòu)建方法在精密度、重復(fù)性和樣品穩(wěn)定性方面進行考察。14種特征性風(fēng)味物質(zhì)的峰面積占總鑒定峰面積的90.18%。

根據(jù)1.3.1所述方法,用發(fā)酵劑科漢森903制作5份酸奶樣品,進行精密度實驗(重復(fù)進樣5次)、重復(fù)性試驗(平行樣品5份)以及穩(wěn)定性試驗(樣品在分別放置0、2、4、8、12和24 h后取樣測定,共6組),記錄主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積,結(jié)果見表3。酸奶特征香氣指紋峰的相對保留時間值的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.3%,相對峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.0%,說明所建立的方法用于酸奶特征香氣指紋圖譜的分析具有良好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性。

表3 指紋圖譜構(gòu)建方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性研究Table 3 Precision,repeatability and stability of fingerprint construction methods

2.5 指紋圖譜的相似度評價

色譜指紋圖譜的相似度是計算原始數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)和夾角余弦值來評價指紋圖譜的必要條件[28]。利用相似性評價軟件、中國藥典委員會推薦的模式識別程序和本實驗室開發(fā)的互補軟件,對色譜圖進行統(tǒng)計評價[29]。10種商業(yè)發(fā)酵劑酸奶相似度分析如表4和圖3所示。

表4 10種商業(yè)發(fā)酵劑酸奶相似度分析Table 4 Similarity analysis of yogurt fermented by 10 commercial starter culture

圖3 10種商業(yè)發(fā)酵劑酸奶特征風(fēng)味指紋圖譜相似度評價Fig.3 Similarity evaluation of flavor fingerprints of yogurt fermented by 10 commercial starter cultures

如圖3所示,對10個飲用型酸奶樣品的GC-MS色譜圖進行分析,利用14個特征峰的相對峰面積進行相似度計算,用于建立普通飲用型酸奶特征風(fēng)味指紋圖譜的10個酸奶樣品通過向量夾角余弦法所得值和相關(guān)系數(shù)法所得值如表4所示。一般認(rèn)為相似度>0.90時,構(gòu)建特征風(fēng)味指紋圖譜的酸奶樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜擁有較好的一致性[30]。這兩種方法得到的相關(guān)度最低值為0.925 5,說明普通飲用型酸奶樣品的風(fēng)味指紋圖譜基本一致。10種商業(yè)發(fā)酵劑酸奶在后熟完成時產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)在整體宏觀上具有較高的相似性。

3 結(jié)論

利用固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)以及主成分分析的方法分析了10種商業(yè)發(fā)酵劑飲用型酸奶的風(fēng)味物質(zhì)。以乙酸作為參考物質(zhì),選擇相對峰面積>1%的14種特征風(fēng)味物質(zhì),建立了能夠反映酸奶特征風(fēng)味的指紋圖譜。10種酸奶中共檢測出61種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),包括醛類9種、酮類11種、酸類7種、酯類11種、醇類15種、芳香族及烷烴化合物8種。通過對構(gòu)建飲用型酸奶特征香氣指紋圖譜的方法進行驗證,表明該構(gòu)建方法具有良好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性。通過相似度分析,證明了所選定的10個酸奶樣品構(gòu)建的指紋信息準(zhǔn)確可靠。利用所構(gòu)建指紋圖譜信息能對不同菌種酸奶特征香氣進行有效區(qū)分。