QuEChERS結合HPLC-MS/MS同時測定魚肉中多種獸藥殘留

劉進璽,王鐵良,胡京枝,楊亞琴,馮慧慧,鐘紅艦

(河南省農業科學院 農業質量標準與檢測技術研究所,農業部農產品質量監督檢驗測試中心,農業部農產品質量安全風險評估重點實驗室,河南 鄭州,450002)

魚肉是居民餐桌上的重要組成部分,其安全性與人民生活息息相關。隨著現代水產養殖業呈集約化和規模化發展,水產生物疫情的爆發頻率也逐漸增高,而生產者和經營者為了預防和治療各種病害、提高產量效益,常在水產生物中使用藥物,加上對這些藥物的毒性和危害認識不足,導致超量和超種類的濫用、誤用、違規使用,以及不遵守休藥期等現象屢禁不止,水產品中藥物殘留超標現象時有發生[1-4]。磺胺類、喹諾酮類、酰胺醇類、硝基咪唑類藥物以及一些違禁添加物,例如孔雀石綠等,因為價格低廉,藥效好而被經常使用。這些殘留在水產品中的藥物經食用后在人體中蓄積,會產生致畸、致癌等嚴重危害[5]。因此,如何提高檢驗效率、降低檢測成本,控制和消除藥殘,保證食品安全,是重大民生課題[6-7]。

由于不同種類間藥物的化學性質差別較大,獸藥多殘留檢測存在諸多困難,如殘留量甚微、獸藥品種繁多、動物源性食品基質復雜等,目前常用的檢測方法大多是測定某一種或某一類藥物。然而在實際工作當中,對于同一個樣品測定多種藥物殘留時,分別測定會涉及多個樣品前處理和多種類型的儀器,耗費大量的人力、物力和時間,檢驗成本高且對環境不友好,面對一些突發事件和應急任務時,分別測定的方法就顯得力不從心,因此,建立簡便、快速、高通量、高靈敏度的方法已成為未來獸藥殘留檢測的趨勢[8-10]。液相色譜串聯質譜技術集中了色譜和質譜的優點,將色譜的分離能力和質譜的高選擇性、高靈敏度結合起來,是近幾年來水、土、動物源性食品及排泄物等基質中多類獸藥殘留快速測定的首選[4,11-21]。

2019年，國家食品安全監督抽查針對淡水魚類共涵蓋了9類藥物殘留,包括喹諾酮類、磺胺類、酰胺醇類、硝基呋喃類代謝物、硝基咪唑類、四環素族、地西泮、五氯酚酸鈉和孔雀石綠,涉及的檢測方法除磺胺類和喹諾酮類藥物可以用《農業部1077號公告-1-2008》同時測定外,其余7類藥物殘留均采用國標或相應標準中檢測方法(GB/T 19857—2005《水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定》、GB/T 20756—2006《可食動物肌肉、肝臟和水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》、SN/T 3235—2012《出口動物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》、GB/T 21318—2007《動物源性食品中硝基咪唑殘留量檢測方法》、GB 23200.92—2016《食品安全國家標準 動物源性食品中五氯酚殘留量的測定 液相色譜-質譜法》)。針對這種情況,本文結合2019年的監督抽查任務,將魚肉中的6類藥物殘留使用QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)的方法進行前處理,利用高效液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)技術,建立了一種同時測定魚肉中磺胺類、喹諾酮類、酰胺醇類、硝基咪唑類、地西泮和孔雀石綠類藥物殘留的檢測技術。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器設備:HPLC-MS/MS 8050液相色譜串聯質譜儀,日本Shimadzu公司;Milli-Q超純水發生器,美國Millipore公司;GL-21B高速冷凍離心機,上海安亭科學儀器廠;雷磁PH S-3C酸度計,上海天美科學儀器有限公司;均質儀,美國Tomtec公司。

試劑:乙腈、甲醇、丙酮,均為色譜純,德國Merck;Na2SO4、NaCl、鹽酸、MgSO4,均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;獸藥標準品,德國Dr.Ehrenstorfer GmbH。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取10 mg(精確至0.01 mg)各個獸藥標準品于10 mL容量瓶中,根據各獸藥的性質用乙腈、甲醇、丙酮等溶劑溶解并定容,制得25種獸藥的單一標準儲備液(1 mg/mL)。根據需要用乙腈稀釋成相應濃度的單一標準工作液。分別吸取一定量的標準儲備液,配制成混合標準儲備液,臨用前稀釋成合適濃度的混合標準工作液。

1.3 HPLC-MS/MS條件

液相色譜條件:CAPCELL PAK C18色譜柱(2.0 mm×100 mm×3 μm),日本資生堂公司;柱溫40 ℃;流動相A相為5 mmol/L甲酸-甲酸銨水溶液,B相為V(乙腈)∶V(甲醇)=1∶1;線性梯度洗脫程序:0～2 min,90% A,2～3 min,90%～85% A,保持10 min,13～20 min,85%～10% A,保持5 min,25～25.1 min,85%～10%A,保持至28 min;流速0.2 mL/min;進樣體積1 μL。

質譜測定條件:電噴霧離子源;正負離子同時掃描;多反應監測模式;各個分析物的質譜信息見表1。

表1 25種分析物的質譜采集參數及保留時間Table 1 MS/MS parameters and retention times of 25 analytes

續表1

1.4 樣品前處理

精確稱量5 g樣品于50 mL離心管中,加入4 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH 4.0)和16 mL 5%甲酸乙腈,劇烈振揺1 min;加入NaCl(1 g)和Na2SO4(4 g),高速均質分散3 min,然后渦旋2 min;10 000 r/min離心12 min備用。

取一個10 mL離心管,裝入300 mg MgSO4和50 mg C18,然后吸取2 mL樣品上清液,渦旋30 s,然后以6 000 r/min離心5 min。吸取1 mL上清液于另一干凈離心管中,加入1 mL水,混勻,過0.22 μm濾膜,待檢測。

2 結果與討論

2.1 儀器條件的選擇

2.1.1 液相條件的確認

水相的選擇方面,實驗對比了加入甲酸、甲酸銨、乙酸、乙酸銨以及它們不同濃度組合時的分離效果,發現加入5 mmol/L甲酸銨-甲酸水溶液時各個分析物的峰形和分離效果最好。有機相的選擇方面,實驗嘗試了乙腈、甲醇以及乙腈和甲醇不同比例組合時的分析效果,結果表明當乙腈和甲醇比例為1∶1時,綜合分離度和峰形最優。綜合考慮最終確定以V(5 mmol/L甲酸銨-甲酸水溶液)∶V(乙腈-甲醇)=1∶1作為流動相。

為了獲得更好的分離度,實驗采用梯度洗脫程序。為了延遲一些高極性化合物的保留時間,實驗初期階段的水相比例較高,而后逐漸降低水相的比例,使得化合物按極性由強到弱順序,逐步被洗脫下來。當全部目標化合物洗脫出來以后,為了使一些強保留的弱極性雜質從柱子上洗脫下來,采用高有機相比例沖洗柱子。經過反復實驗,綜合考慮分離度和總分析時間,確定1.3中的梯度洗脫程序為最佳方案。圖1所示為25種獸藥在該條件下的總離子流圖。

圖1 25種獸藥混合標準溶液的總離子流圖(50 μg/L)Fig.1 Mass spectra of veterinary drug residues

2.1.2 質譜條件的確認

通過分別注射單一標準溶液,使用儀器自動優化的方法獲得各個目標化合物的最優質譜條件。根據各個化合物的保留時間,分窗口采集信號,以便獲得良好的靈敏度。

2.2 提取溶劑的選擇

考慮到本文所涵蓋的幾類藥物化學性質差異顯著,本文比較了乙腈、甲醇、0.2%甲酸乙腈、0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液+乙腈、0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液+0.2%甲酸乙腈作為提取液時的提取效率。結果表明,0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液+0.2%甲酸乙腈作為提取溶劑時幾類化合物的綜合提取效率最優。因此實驗初步選定提取溶劑為:0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液+0.2%甲酸乙腈。

實驗又進一步比較了不同酸度的提取溶液對提取效率的影響,比較了0.2%、0.4%、1%、3%、5%、7%甲酸乙腈+0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液作為提取溶劑時的實驗效果,結果表明,在0.2%～7%,隨著pH值的不斷下降,喹諾酮類化合物的回收率逐步上升,但磺胺類化合物的回收率不斷下降,其他幾類化合物回收率先上升再下降。統籌考慮,最終選定0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液+5%甲酸乙腈作為提取溶劑。

2.3 鹽析劑和脫水劑的確定

實驗比較了鹽析劑NaCl和乙酸鈉,脫水劑Na2SO4和MgSO4對實驗結果的影響,并進一步確認了它們的用量。結果表明,加入乙酸鈉和MgSO4會釋放熱量,造成一些獸藥的回收率下降。實驗最終確定NaCl作為鹽析劑,用量為1 g;Na2SO4作為脫水劑,用量為4 g。

2.4 凈化劑的確定

為了減少干擾物,降低基質效應的影響,需要對樣品進行凈化。常規的凈化除雜填料有N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)、C18、—NH2吸附劑和石墨化炭黑(graphitizing of carbon black,GCB)等。PSA和—NH2主要用來除去脂肪酸、糖類等極性雜質;C18主要吸附非極性物質和油脂類雜質;GCB能吸附弱極性和具有苯環結構的化合物,會導致該類化合物回收率的下降,對本文所涉及的一些藥物不適用。

本文比較了PSA、C18的除雜效果,結果表明:PSA能使磺胺類藥物的回收率大幅降低,這可能是因為PSA吸附了該類化合物;C18能起到很好的凈化作用,并有較好的回收率。因此,選用C18來去除雜質。

實驗又進一步比較了C18和MgSO4不同用量配比時的除雜效果,分別為:30和200 mg,50和300 mg,100和600 mg,150和900 mg。結果表明50 mg C18和300 mg MgSO4時凈化效果為滿意,隨著凈化劑用量的進一步增加,凈化效果沒有明顯提升。統籌考慮做樣成本和除雜效果等原因,最終確定凈化劑為50 mg C18和300 mg MgSO4。

2.5 方法學評價

2.5.1 線性關系和檢出限

根據需要準確吸取一定量1.2中制備的標準儲備液,配制成一系列質量濃度(0.1、0.2、0.5、1、5、10、50、100、200 μg/L)的混合標準工作液,在1.3的儀器條件下進行實驗。以各個化合物的濃度和峰面積為橫縱坐標,繪制線性關系曲線。結果得到25種化合物的相關系數范圍0.990 2～0.999 9,說明25種獸藥在0.1～200 μg/L具有良好的線性關系。

2.5.2 準確度和精密度

以草魚樣品為基質空白,進行5個重復3個水平(2、4和10 μg/kg)的添加回收實驗,實驗結果見表2。25種化合物的平均回收率為71.8%～107%,相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為4.4%～9.2%,該方法精密度和準確度能滿足現有法規的要求,可用于準確定量,適用于實際樣品的測定。

表2 獸藥殘留添加回收表Table 2 Recoveries and precisions of veterinary drug residues

2.6 實際樣品的測定

本課題組在2019年的食品安全監督抽查工作中,魚類產品共檢出恩諾沙星、氧氟沙星、磺胺嘧啶若干份,其中恩諾沙星最低值16 μg/kg,最高值596 μg/kg,氧氟沙星最低值28.9 μg/kg,最髙值476 μg/kg,磺胺類總量(磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺喹惡啉之和)最低值13.2 μg/kg,最髙值113 μg/kg。使用本文所述的方法,對檢出的陽性樣品與國標法進行方法比對試驗,實驗結果采取F檢驗方法進行單因素方差分析,結果顯示2種方法在顯著性水平為0.05水平時,無顯著性差異(表3)。

表3 國標法與本文所建立方法檢測結果對比表 單位：mg/kg

3 結論

本研究建立了使用QuEChERS前處理方法,同時測定魚肉中磺胺類、喹諾酮類、酰胺醇類等藥物多殘留的檢測技術。該技術的前處理方法簡單、快速,方法學評價結果符合獸藥殘留的相關要求。使用本文建立的方法對實際工作中檢出的陽性樣品進行測定,結果表明該方法和國標法測定結果無顯著差異,該方法可以用于實際樣品的檢測。