南方紅豆杉水提物對TGF-β 誘導的NCI-N87 細胞上皮間質轉化的影響

鄒媛媛

（杭州市蕭山區中醫院消化內科 浙江 杭州 312000）

胃癌是常見惡性腫瘤之一，發病率居高不下。最近的國家癌癥中心數據顯示，胃癌在男性惡性腫瘤中發病排第2 位，女性第5 位，預后相對差，整體病死率位列第3 位[1]。南方紅豆杉已被證明[2]，可抑制致癌物活化、血管生成、抗侵襲和轉移，還具有調節細胞的存活率。目前已知南方紅豆杉水提物通過抑制PI3K/AKT 信號通路的激活來抑制癌細胞的侵襲，但是，南方紅豆杉的抗侵襲、轉移的特性，是否與抑制上皮間質轉化有關還得進一步確認。本實驗通過體外研究，探討南方紅豆杉水提物對胃癌NCI-N87 細胞上皮間質轉化（EMT）功能及相關機制，報道如下。

1.資料與方法

1.1 細胞與細胞培養

HER2 陽性人胃癌NCI-N87 細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，在浙江中醫藥大學實驗中心培養。NCI-N87 細胞培養于5% CO2，37 ℃培養箱（濕度95%）條件下，培養于含10% FBS，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/mL 的RPMI1640 培養基中。實驗時取對數生長期細胞。本研究經浙江中醫藥大學實驗中心倫理委員會批準（倫理審批號：KYLL-2020-127）。

1.2 藥物

南方紅豆杉，規格8 g/包，采購自寧波泰康紅豆杉生物工程有限公司。將80 g 南方紅豆杉放置于無菌容器中進行浸泡，過夜浸泡12 h，再使用8 倍清水將其煮沸30 min，倒出藥液。將藥液放入5 倍清水中，煮沸20 min，使用真空抽濾器對藥液進行過濾，并將其中水分蒸發至100 mL，此后使用旋轉蒸發儀，通過水浴法將藥液濃縮至40 mL，再使用真空干燥箱對其進行干燥，得浸膏，其濃度計算后為10.65%。取用1 g 南方紅豆杉膏狀提取物放入10 mL 超純水中，待其溶解后，使用高速冷凍離心機12 000 rpm 對其進行離心15 min 后取上清液，再通過0.22 μm 微孔濾膜進行除菌處理，最后制成母液濃度100 mg/mL，并置于-20 ℃的冰箱中備用。

1.3 試劑及儀器

轉化生長因子β（TGF-β），貯藏在2 ～8 ℃冰箱中備用。抗體包括：E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白均購自美國Sigma Aldrich 公司。Transwell 試劑盒，采購于美國康寧，細胞侵襲浸潤試劑盒購自Millipore。本研究所有儀器設備，均有由浙江中醫藥大學實驗中心提供。

1.4 方法

（1）造模及分組NCI-N87 細胞培養到對數生長期1×105/孔接種于24 孔細胞培養板中，加入轉化生長因子10 mg/L 誘導48 h。同時對照組選取小牛血清白蛋白子10 mg/L 誘導48 h，使用聚焦顯微鏡對其進行觀察并拍照，用過觀察發現轉化生長因子誘導的細胞不再是多角形生長而是轉化為長梭形間充質細胞形態，且細胞多分散為單個，出現遷徙突觸。對照組細胞呈上皮細胞形態，形似鵝卵石，且細胞分布較為密集。采用奇偶分組法，將其分為5組，分別是空白對照組、TGF-β誘導組（10 mg/L）、TGF-β+（低、中、高劑量）紅豆杉組，劑量分別為（400、800、1 600 μg/mL）。（2）細胞體外遷移、侵襲實驗Transwell 小室、基質膠和移液槍頭提前在4 ℃冰箱預冷30 min。使用無血清培養基對進行1:4 稀釋，同時分別將稀釋膠50 μL緩慢加入到24-well Transwell小室中，使其將上室底部均勻鋪滿，并放置于37 ℃培養箱中進行孵育5 h；再將上室中殘余液體吸出，將50 μL 無血清培養基添加至每個小室中，溫度37 ℃，時間30 min，再吸去培養基。將200 μL 細胞懸液加入Transwell 小室的上室每孔中，操作時要避免氣泡出現，并控制細胞分布均勻；600 μL 含20%胎牛血清的細胞培養基加入至下室中，并一齊放入培養箱中進行孵育；等待細胞狀態恢復且完全貼壁，再對其進行分組；與劃痕實驗相一致。將培養箱中Transwell 小室取出，去除培養液，使用PBS清洗3 遍；采用甲醇將膜下室細胞進行固定30 min，并風干小室；將600 μL 0.1%結晶紫染色液滴入24 孔板中，同時將小室放入其中，確保基底膜浸在染色液中，溫度37 ℃，時間30 min；再使用PBS 清洗3 遍，用棉簽將上室面的非侵襲細胞擦除干凈，選取100 倍顯微鏡下的5 個不同的隨機角度，對侵襲到膜下室面的細胞進行計數拍照，取5 個視野下的平均數值。（3）Western blotting 法檢測EMT 相關蛋白表達，將NCI-N87 細胞以30 萬/孔接種于6 孔板，用TGF-β 處理24 h，之后加入不同濃度南方紅豆杉水提物處理24 h，棄細胞培養液，PBS 沖洗，將蛋白提取液樣品作（聚丙烯酰胺凝膠）SDS-PAGE 電泳后轉膜，封閉處理后放入一抗（鼠抗人，稀釋度為1:1000）孵育2 ～3 h，洗滌緩沖液洗膜3 遍，10 min/遍左右；放入抗體稀釋濃度為1:2 500 的二抗，洗滌緩沖液洗膜3 遍，10 min/遍左右，并浸入適量比例的化學發光試劑中（A 液與B 液比例為1:1）1 min，取出后在室溫條件下進行干燥，同時使用用保鮮膜將其包置于暗盒中，壓片曝光3 ～10 min，洗出成片，觀察相應結果。（4）實時定量RT-PCR 將NCI-N87 細胞以30萬/孔接種于6 孔板，用TGF-β 處理24 h，之后加入不同濃度南方紅豆杉水提物處理24 h，棄細胞培養液，預冷的PBS 沖洗，每孔加入Trizol 試劑提取各組細胞總RNA，檢測純度，按試劑盒說明逆轉錄合成cDNA，同時內參照物選擇管家基因β-actin mRNA，對mRNA 表達量進行定量分析；設計相關引物時需依照GeneBank 上的基因序列，聚合酶鏈式反應產物需要放置于瓊脂糖凝膠進行電泳分離，對聚合酶鏈式反應產物進行分析時選用Bio-1D 凝膠分析軟件。所有實驗均重復至少3 次。

1.5 統計學方法

采用SPSS 18.0 統計軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（± s）表示，采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 南方紅豆杉水提物抑制TGF-β 誘導的NCI-N87細胞在體外劃痕、遷移和侵襲實驗

轉化生長因子組24 h 后侵襲穿膜的細胞數較空白對照組具有顯著提高；轉換生長因子中加入南方紅豆杉組24 h 后侵襲穿膜的細胞數有所減少，且中藥劑量越高，細胞數越少；轉化生長因子的誘導可使NCI-N87 細胞遷移和侵襲增強，而南方紅豆杉能夠抑制轉化生長因子對細胞遷移和侵襲能力的誘導作用，呈一定的劑量依賴性。

2.2 南方紅豆杉水提物抑制NCI-N87 細胞上皮間質轉化

與對照組相比，轉化生長因子處理后的細胞E-鈣黏蛋白表達減少，而N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達增加；南方紅豆杉能抑制TGF-β 誘導的NCI-N87 細胞EMT，引起E-鈣黏蛋白的增加而N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達抑制。

2.3 南方紅豆杉水提物通過PI3K/AKT 信號通路抑制TGF-β 誘導EMT

與對照組相比，TGF-β 組PI3K、Akt、p-Akt 的表達均增加；給藥后各治療組mRNA 表達與TGF-β 組相比均降低，差異有統計學意義（P＜0.05），且呈劑量相關性；同空白對照組相比，TGF-β+低劑量紅豆杉組高于空白對照組；TGF-β+中劑量紅豆杉組高于空白對照組；統計學無顯著差異；TGF-β+高劑量紅豆杉組低于空白對照組差異有統計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 Real-time PCR 檢測PI3K、AKT1、mTOR 基因表達（± s）

表1 Real-time PCR 檢測PI3K、AKT1、mTOR 基因表達（± s）

組別 劑量 PI3K空白對照組 0 0.7018±0.0676 TGF-β 組 10 mg/L 0.9901±0.3977 TGF-β+低劑量紅豆杉組 10 mg/L+400 μg/mL 0.9683±0.1323 TGF-β+中劑量紅豆杉組 10 mg/L+800 μg/mL 0.7616±0.0112 TGF-β+高劑量紅豆杉組 10 mg/L+1 600 μg/mL 0.5234±0.0386組別 AKT1 mTOR空白對照組 0.612±0.0753 0.5013±0.1182 TGF-β 組 1.2286±0.1675 1.0532±0.0158 TGF-β+低劑量紅豆杉組 1.0858±0.1456 0.8172±0.0674 TGF-β+中劑量紅豆杉組 0.8018±0.3867 0.6926±0.0678 TGF-β+高劑量紅豆杉組 0.5656±0.1778 0.4162±0.0652

3.討論

胃癌5 年生存率和預后差的主要原因是腫瘤能夠浸潤、侵襲和轉移淋巴結、遠端組織以及周圍組織，大部分胃癌或胃食管結合部癌患者在診斷時已為進展期、轉移晚期或不可手術階段，預后較差。上皮間質轉化（EMT），由上皮細胞脫黏附轉變成有遷移能力的間質細胞，主要作用于胚胎發育、腫瘤轉移等相關機理。據相關研究分析[3]，多種細胞外信號可使上皮間充質轉化得到激發，包括細胞膠原、透明質酸，多種可溶性生長因子等，均能對EMT誘導信號通路產生激活作用。包括TGF信號通路、受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK）通路以及Notch 通路等。轉化生長因子屬于EMT 誘導因子的一種，除對經典Smad 依賴的信號通路進行激活外，還能使多條EMT 非經典信號通路得到激活，包括Ras/MAPK、PI3K/AKT 等信號通路，進而促使上皮間充質轉化發生[4]。腫瘤細胞生長因子EGF、VEGF 表達上調依賴于TGF-β誘導，其作為細胞外刺激信號通過激活PI3K/AKT 通路促進細胞增殖和轉移[5]。實驗表明，TGF-β 誘導胃癌NCI-N87 細胞后可激活PI3K/AKT 通路促進胃癌NCI-N87細胞EMT 和轉移。本實驗通過加入轉化生長因子刺激NCI-N87 胃癌細胞誘導上皮間質轉化，對南方紅豆杉水體物抑制PI3K/AKT 信號通路調控以及逆轉上皮間質轉化的發生進行分析。

南方紅豆杉性平、味甘、入肺、胃、大腸經，具有軟堅散結的功效[5]。南方紅豆杉在我國分布最為廣泛，據相關研究表明，紅豆杉中包含紫杉醇、紫杉黃酮、小分子類物質（鞣質）、紅豆杉多糖、等40 多種有效成分[6]。紅豆杉提取物的主要作用原理是對腫瘤細胞SMMC-7721和HEp-2 進行誘導，使其凋亡，從而對腫瘤細胞生長起到抑制作用；同時促進合成干擾素、腫瘤壞死因子以及白介素-2 等細胞因子；并使T 淋巴細胞、B 淋巴細胞以及腫瘤細胞得到激活，從而使抗體與補體免疫功能提高。南方紅豆杉具有抑制人HER2 陽性胃癌NCI-N87 細胞生長的作用，能夠使其繁殖受阻，進而死亡。南方紅豆杉水提物能夠抑制HER2 陽性裸鼠移植瘤生長，并將其殺死，同時還可以阻礙胃癌細胞成長，但是其對NCI-N87 胃癌細胞上皮間充質轉化是否有逆轉作用尚需進一步研究。

本文結果顯示南方紅豆杉能通過PI3K/AKT 信號通路抑制TGF-β 誘導的EMT，進而減弱NCI-N87 細胞侵襲遷移能力。本研究明確了南方紅豆杉抑制人胃癌NCI-N87細胞侵襲轉移作用與PI3K/AKT 信號通路有關，但是PI3K/AKT 信號通路家族成員眾多，對此信號通路作用靶點仍需進一步的研究。