不同濃度6-BA和ZT誘導芍藥離體葉片愈傷組織的效果

趙 敏

(徐州生物工程職業技術學院， 江蘇 徐州 221006)

芍藥(PaeonialactifloraPall.)是芍藥亞科(Subfam. Paeonioideae)芍藥屬(Paeonia)落葉亞灌木，不僅是供觀賞的經濟植物，還有很高的藥用價值。近年來，因為連續栽種芍藥導致土壤中積累很多有致病威脅的病菌，對芍藥的產量構成極大威脅。目前芍藥的繁殖方法有播種、嫁接、分株、扦插、壓條等方式，分株和播種是常使用的繁殖方法，采用分株繁殖的方法操作簡便，可行性高，但是成活率低；播種方法培育的后代容易發生變異，不能將親本的優良性狀進行有效保留[1]。植物組織培養技術是植物培育研究中的基本實驗技術和研究手段，具有繁殖系數較高、周期短，可很好保留母株的優良性狀等有諸多優勢，在對植株脫毒、選育新品種、快速繁殖、人工培育種子和植物藥用成分生產中得到廣泛應用，為植物基因工程創造了前提條件[2]。在組織培養條件中，最重要的是植物生長調節劑的種類和濃度，目前使用最多的生長素有 2，4-D、NAA、IAA、IBA等，而6-BA、TDZ、KT、ZT 這些植物激素是最常用的細胞分裂素，采用2種及以上生長素與分裂素互相搭配使用，對促進愈傷組織誘導、增殖及不定芽的分化有更好的效果。但芍藥的組織培養技術研究還處于基礎研究階段，研究內容主要在選擇外植體和培養基配方方面，少部分研究培育出了生長出根的植株，需要對芍藥的擴繁育苗體系進行更深入的研究。為此，筆者于2021年4月22日對芍藥外植體選擇與處理、愈傷培養基選擇、組培中存在的褐化問題進行研究，以期對利用組培技術進行芍藥離體繁殖提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

芍藥的植物組織采自徐州生物工程職業技術學院農林系的芍藥試驗花田。選擇生長旺盛、枝繁葉茂、枝干粗壯的健康芍藥，采取生長旺盛、無病蟲害的植株葉片作為供試材料。

1.2 試驗設計

選取在芍藥、牡丹器官培養運用較最為廣泛的MS培養基，以 1/2 MS +2，4-D 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L為基本培養基，pH 5.8。在基本培養基中添加不同濃度的 6-BA(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L)或ZT(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L)，共設置7個不同配比處理(表1)，每個配比重復3瓶，每個瓶內接種4個處理好的無菌外植體。培養條件：溫度25℃、濕度60%、光周期12 h/d。

表1 芍藥離體葉片愈傷組織誘導培養基的激素組合

將芍藥離體葉片的愈傷組織轉移到繼代培養基中，定期觀察愈傷組織是否出現褐化現象。繼代培養基以 1/2MS 作為基本培養基，加入不同濃度的2，4-D、NAA、6-BA、ZT，組合成7個不同濃度配比(表2)。

表2 芍藥離體葉片愈傷組織繼代培養基的激素組合

1.3 試驗方法

于9月選取長勢良好的芍藥植株摘取頂部新生嫩葉，將芍藥葉片放入培養皿中，覆蓋細密紗布，用自來水沖洗1.5 h，擦干水分后將葉片放入超凈工作臺，徹底消毒滅菌，將外植體表面存在的微生物徹底滅活以避免產生菌斑影響試驗結果，同時要求對外植體組織和表層細胞的傷害降至最低。先用75%酒精進行消毒，持續30 s，用無菌水沖洗3～5次，再用0.1%氯化汞消毒5 min，再使用無菌水沖洗 3～5次，消毒過程重復3次，最后再使用無菌水沖洗3～5次，在超凈工作臺將葉片切成 5 mm×5 mm小塊進行誘導培養[3]。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織的誘導效果

從表3看出，芍藥離體葉片愈傷誘導率最高為A-4，達83.3%，誘導出離體葉片愈傷組織的速度最快，為26 d，且誘導的愈傷組織體積大、長勢好，在3～4 d出現褐化；A-3、A-6誘導離體葉片愈傷組織的效果次之，誘導率分別為66.7%、58.3%，誘導出愈傷組織的時間分別為27 d、29 d，且誘導出的愈傷組織在4～5 d出現褐化；A-2、A-5、A-7誘導離體葉片愈傷組織的效果較差，誘導率分別為25.0%、41.7%、50.0%，誘導出愈傷組織的時間分別為30 d、31 d、32 d，在3～5 d出現不同程度褐化。總體而言，使用6-BA和ZT具有細胞分裂活性的分裂素都能夠有效誘導生長點的分化，且6-BA的效果比ZT好，最佳離體葉片誘導愈傷組織培養基的配方為1/2 MS +2，4-D 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+LH 0.5 g/L+6-BA 1.5 mg/L。

表3 不同培養基對芍藥愈傷組織的誘導效果

2.2 愈傷組織的繼代培養效果

芍藥是一種多年生草本植物，次生代謝比較旺盛，而且植株內還含有很多自身合成的酚類化合物，因此在組織培養過程中外植體很容易發生褐化。從表4看出，B-7誘導出愈傷組織到褐化的時間最長，達117 d，說明B-7培養基能夠有效抑制酚類物質的產生和延緩愈傷組織發生褐化的時間，這對于芍藥愈傷組織的繼代培養十分有利。因此，在芍藥愈傷繼代培養中應選用B-7號培養基。

表4 不同濃度激素對芍藥愈傷組織的繼代培養效果

3 小結

用1/2 MS作為基本培養基，添加不同濃度6-BA或ZT，對芍藥離體葉片愈傷組織進行培養，結果表明，6-BA和ZT具有細胞分裂活性的分裂素都能夠有效誘導生長點的分化，且6-BA的效果比ZT好，當 6-BA濃度為 1.5 mg/L時芍藥離體葉片愈傷組織的誘導效果最好(誘導率83.3%)，即最適誘導培養基為1/2 MS +2，4-D 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+LH 0.5 g/L+蔗糖 30 g/L+瓊脂 7 g/L+6-BA 1.5 mg/L；最適繼代培養基為1/2 MS 0.1 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+ZT 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+6-BA 1.5 mg/L。

在試驗操作中芍藥愈傷組織易被污染，培養基、超凈工作臺及容器等器具在前期一定要做到徹底消毒、規范操作等。芍藥組織培養一般難生根，這也是芍藥組織培養快速繁殖技術難以應用于生產的原因。芍藥離體組織快速繁殖技術在理論上已經被證實具有可行性，但與實際生產試驗中有較大差距，主要是繼代時間、激素類型、生根方法等多因素會影響到誘導生根，還存在過高的外植體褐化率、很低的不定芽增殖率等較多問題。因此，芍藥離體組織快速繁殖技術還需要進一步深入研究，以建立高效率且穩定的植株再生及離體快繁技術體系。