銀杏總黃酮對IL-1β誘導的髓核細胞凋亡及Nrf2/ARE信號通路的影響

李 靜，黃婭芬，夏曉楓，唐家國

(1.湖北省武漢市第三醫院骨科，湖北 武漢 430000 2.長江航運總醫院骨科，湖北 武漢 430010)

腰椎間盤退變是引起腰椎疾病及腰腿痛的重要原因，據世界流行病學分析，我國每年罹患腰椎疾病的患者約達800～1000萬人，嚴重影響我國國民的生活質量[1]。腰椎間盤退變機制及病理因素復雜，一直是骨科研究的重點[2]。近來研究發現髓核細胞衰老、凋亡、氧化應激及炎癥反應等病理因素是導致腰椎間盤退變的主要原因[3]。但引起髓核細胞凋亡的分子生物學機制，還不甚明確。核因子E2相關因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)信號通路可調控細胞凋亡、氧化應激及炎癥反應等生理活動來參與疾病的發展過程[4]，Nrf2入核后可激活抗氧化、抗炎途徑，對髓核細胞炎癥損傷及凋亡具有保護作用，逐漸受到骨科學者研究的重視[5]。另外，尋找抑制髓核細胞凋亡的有效藥物，對治療腰椎間盤退變，緩解患者腰椎疼痛有一定的臨床意義。銀杏總黃酮(total flavonoids of Ginkgo biloba，TFG)為銀杏葉提取物中的重要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗細胞凋亡等多種藥理作用，且對阿爾茨海默癥等神經系統退化性疾病的神經損傷及神經凋亡有一定改善作用[6]。但TFG對髓核細胞凋亡的影響還未見報道，本研究通過體外白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)誘導建立髓核細胞凋亡模型，探究TFG對髓核細胞凋亡及Nrf2/ARE通路的影響，以期為TFG的開發應用及腰椎間盤退變的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1細胞來源:人椎間盤髓核細胞(上海梵態生物科技有限公司，批號：FT-LY0104)。

1.1.2主要藥物、試劑與儀器:TFG(北京儀化通標科技有限公司，原料藥，純度99%，批號：PRF00159)；DMEM培養基、IL-1β溶液(北京凱瑞基生物科技有限公司，批號：120026、140057)；CCK-8試劑盒(武漢科昊佳生物科技有限公司，批號：CK04-500T)；Nrf2通路抑制劑(Brusatol)(美國MCE公司，批號：HY-19742)；hochest 33258染色試劑盒(江蘇凱基生物技術有限公司，批號：KGA211)；活性氧熒光探針(DCFH-DA)(上海懋康生物科技有限公司，批號：MX4803-10)；Nrf2、ARE、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血紅素加氧酶1(HO-1)、GAPDH單克隆抗體、羊抗人二抗(美國abcam公司，批號：ab2302、ab89443、ab255275、ab189491、ab89119、ab10003、ab10117)；化學發光顯色試劑盒(上海士鋒生物科技有限公司，批號：R1686)；酶標儀(深圳市恩科生物科技有限公司，型號：Sunrise)；熒光顯微鏡(南京貝登醫療股份有限公司，型號：CX43)；化學發光成像系統(北京原平皓生物技術有限公司，型號：Tanon 5200)。

1.2方 法

1.2.1細胞培養:取椎間盤髓核細胞常規復蘇后，用含20%胎牛血清和DMEM培養基于恒溫培養箱(37℃、5% CO2)中培養，并用胰蛋白酶進行消化傳代。

1.2.2CCK-8法檢測不同濃度TFG對椎間盤髓核細胞增殖活性的影響:取椎間盤髓核細胞分為正常組、IL-1β誘導組、二甲基亞砜(DMSO)組、TFG不同濃度組(5、10、20、40、80、160mg/mL)組，每組設置6個復孔(1×105個/孔)。正常組常規培養不做任何處理；IL-1β誘導組參照文獻[7]加入濃度為10ng/mL的IL-1β溶液誘導髓核細胞凋亡；DMSO組加入濃度為10ng/mL的IL-1β溶液和0.1% DMSO溶液作為陰性對照；TFG不同濃度組加入濃度為10ng/mL的IL-1β溶液以及參照文獻[8]設置劑量并加入濃度為5、10、20、40、80、160mg/mL的TFG溶液(TFG預先用0.1%的DMSO溶解)進行干預培養。各組均培養24h后取細胞，按CCK-8試劑盒說明書方法，加入CCK-8溶液繼續培養2h后，用酶標儀讀出各組細胞的OD值(450nm波長)，另取空白培養基進行OD檢測作為空白OD值，根據公式細胞存活率(%)=[(試驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%，計算細胞存活率，存活率越大預示細胞增殖活性越高，并篩選出適宜的TFG濃度進行后續實驗。

1.2.3細胞分組處理:將椎間盤髓核細胞分為正常對照組、IL-1β誘導組、TFG低(20mg/mL)、高(80mg/mL)劑量組、Nrf2通路抑制劑組(Brusatol組，0.2μg/mL)、TFG+Brusatol組(80mg/mL+0.2μg/mL)，每組設置6個復孔(1×105個/孔)。正常對照組不做任何處理，正常培養；除正常對照組外，其余各組均加入濃度為10ng/mL的IL-1β溶液誘導髓核細胞凋亡[7]，TFG低、高劑量組加入濃度為20mg/mL、80mg/mL的TFG溶液；Brusatol組參照文獻[9]加入濃度為0.2μg/mL的Nrf2通路抑制劑(Brusatol)溶液；TFG+Brusatol組加入濃度為0.2μg/mL的Brusatol及80mg/mL的TFG溶液干預培養。各組均培養24h后進行后續實驗。

1.2.4CCK-8法檢測細胞增殖活性:取1.2.3項中處理后的各組細胞，按1.2.2項中CCK-8法操作方法檢測髓核細胞增殖活性。

1.2.5hochest 33258染色檢測細胞凋亡情況:取1.2.3項中處理后的各組細胞，按hochest 33258染色試劑盒說明書方法對各組細胞進行染色后，置于熒光顯微鏡下觀察，各組隨機選取5個視野，計數凋亡細胞數目(細胞核染色為亮藍色的細胞)及細胞總數目(細胞核染色為亮藍色的細胞數目+細胞核染色為均勻淡藍色的細胞數目)，并計算細胞調亡率(細胞調亡率=凋亡細胞數目/細胞總數目×100%)。

1.2.6免疫熒光染色法檢測細胞中活性氧(ROS)含量:取1.2.3項中處理后的各組細胞，加入DCFH-DA探針并于室溫下孵育20min后，置于熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況，并隨機取5個視野，用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統單位面積內綠色熒光強度強弱，以單位面積內熒光強度代表細胞中ROS相對含量。

1.2.7免疫熒光共聚焦法檢測Nrf2入核情況:取1.2.3項中處理后的各組細胞，加入濃度為20μmoL/L的特丁基對苯二酚(TBHQ)處理45min、丙酮固定10min、0.25%曲拉通(TritonX-100)室溫透化6min、用含1%牛蛋白血清室溫封閉1h后，加入Nrf2特異性一抗(1：200)低溫(4℃)孵育過夜，再用Aexa Fluor488熒光標記的二抗室溫孵育1h后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光染核3min，用防猝滅液封片后于激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.8蛋白免疫印跡法檢測各組細胞Nrf2、ARE、cleaved caspase-3、TNF-α、HO-1蛋白表達水平:取1.2.3項中處理后的各組細胞，用胰蛋白酶消化、蛋白裂解液4℃裂解25min后3000r/min離心15min取上清液提取總蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度。取25μg蛋白樣品行上樣、跑膠、轉膜與電轉反應、封閉后，加入一抗(Nrf2、ARE、cleaved caspase-3、TNF-α、HO-1、GAPDH抗體，稀釋倍數均為1∶1500，內參抗體GAPDH稀釋倍數為1∶3000)，于4℃冰箱內孵育過夜，加入二抗(稀釋4500倍的辣根過氧化物HRP)室溫下孵育1.5h。用化學發光試劑盒顯影后在化學發光成像分析系統下拍照并分析灰度值。每組試驗重復3次。

2 結 果

2.1不同濃度TFG對椎間盤髓核細胞增殖活性的影響:與正常組比較，IL-1β誘導組、DMSO組細胞增殖活性降低(P<0.05)。與IL-1β誘導組比較，隨著TFG濃度升高，細胞增殖活性逐漸升高，在80～160mg/mL時保持在穩定水平，其中20、40、80、160mg/mL TFG組細胞增殖活性與IL-1β誘導組比較差異有統計學意義(P<0.05)。DMSO組與IL-1β誘導組比較、80mg/mL TFG組與160mg/mL TFG組比較，差異均無統計學意義(P<0.05)，選用20mg/mL、80mg/mL為TFG低、高劑量組進行后續試驗。見圖1。

圖1 各組髓核細胞存活率比較

2.2TFG對椎間盤髓核細胞增殖活性的影響:與正常對照組比較，IL-1β誘導組細胞增殖活性降低(P<0.05)。與IL-1β誘導組比較，TFG低、高劑量組細胞增殖活性升高(P<0.05)，且TFG高劑量組高于TFG低劑量組；Brusatol組細胞增殖活性降低(P<0.05)。與TFG高劑量組比較，TFG+Brusatol組細胞增殖活性降低(P<0.05)。見表1。

表1 TFG處理后各組細胞增殖活性比較

2.3TFG對椎間盤髓核細胞凋亡率的影響:hochest 33258染色顯示，凋亡細胞核染色為亮藍色熒光，正常細胞核染色為均勻淡藍色熒光。與正常對照組比較，IL-1β誘導組細胞凋亡率升高(P<0.05)。與IL-1β誘導組比較，TFG低、高劑量組細胞凋亡率降低(P<0.05)，且TFG高劑量組低于TFG低劑量組；Brusatol組細胞凋亡率升高(P<0.05)。與TFG高劑量組比較，TFG+Brusatol組細胞凋亡率升高(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 各組細胞hochest 33258染色圖(×400)

2.4TFG對椎間盤髓核細胞ROS含量的影響:與正常對照組比較，IL-1β誘導組ROS含量升高(P<0.05)。與IL-1β誘導組比較，TFG低、高劑量組ROS含量降低(P<0.05)，且TFG高劑量組低于TFG低劑量組；Brusatol組細胞ROS含量升高(P<0.05)。與TFG高劑量組比較，TFG+Brusatol組ROS含量升高(P<0.05)，見圖3，表3。

表2 各組細胞凋亡率比較

圖3 各組細胞ROS免疫熒光染色圖(×400)

表3 各組細胞ROS含量比較

2.5TFG對椎間盤髓核細胞Nrf2入核情況的影響:綠色熒光為Nrf2蛋白，藍色熒光為細胞核。與正常對照組比較，IL-1β誘導組Nrf2入核數目升高(P<0.05)。與IL-1β誘導組比較，TFG低、高劑量組Nrf2入核數目升高(P<0.05)，且TFG高劑量組高于TFG低劑量組；Brusatol組Nrf2入核數目降低(P<0.05)。與TFG高劑量組比較，TFG+Brusatol組Nrf2入核數目降低(P<0.05)。見圖4，表4。

圖4 各組細胞Nrf2免疫熒光染色圖(×400)

表4 各組細胞Nrf2入核數目比較

2.6TFG對椎間盤髓核細胞Nrf2、ARE、cleaved caspase-3、HO-1、TNF-α蛋白表達的影響:與正常對照組比較，IL-1β誘導組Nrf2、ARE、cleaved caspase-3、HO-1、TNF-α蛋白表達水平升高(P<0.05)。與IL-1β誘導組比較，TFG低、高劑量組Nrf2、ARE、HO-1蛋白表達水平升高(P<0.05)，cleaved caspase-3、TNF-α蛋白表達水平降低(P<0.05)，且TFG高劑量組Nrf2、ARE、HO-1蛋白表達水平高于TFG低劑量組(P<0.05)，cleaved caspase-3、TNF-α蛋白表達水平低于TFG低劑量組(P<0.05)；Brusatol組Nrf2、ARE、HO-1蛋白表達水平降低(P<0.05)，cleaved caspase-3、TNF-α蛋白表達水平升高(P<0.05)。與TFG高劑量組比較，TFG+Brusatol組Nrf2、ARE、HO-1蛋白表達水平降低(P<0.05)，cleaved caspase-3、TNF-α蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖5，表5。

表5 各組細胞Nrf2 ARE cleaved caspase-3 HO-1 TNF-α蛋白表達水平比較

圖5 各組細胞Nrf2、ARE、cleaved caspase-3、HO-1、TNF-α蛋白表達免疫印跡圖

3 討 論

椎間盤退變引起的腰椎疼痛給患者及社會帶來了巨大的經濟負擔。髓核細胞過度凋亡在椎間盤退變過程中起關鍵作用。Chen[10]等研究發現，椎間盤退變過程中，多種因素如異常機械負荷、椎間盤細胞基質合成與分解失衡等，會促進炎性細胞因子水平如IL-1β和TNF-α分泌，引起髓核細胞凋亡，導致椎間盤結構和功能的改變，進而加速椎間盤退變的病理過程，并認為減少炎癥反應，抑制髓核細胞凋亡，可能是治療椎間盤退變的有效策略。本研究用IL-1β體外誘導培養髓核細胞后，發現髓核細胞增殖活性降低，細胞凋亡率升高，并伴隨著凋亡蛋白cleaved caspase-3及炎癥因子TNF-α的顯著升高，提示IL-1β誘導的髓核細胞凋亡模型造模成功。另外炎癥反應又常伴隨著氧化應激反應，且研究證實髓核細胞是ROS的來源之一。Li等[11]發現過多的ROS是導致椎間盤退變患者髓核細胞基質合成損傷及衰老凋亡的危險因子之一。本研究也在髓核細胞凋亡過程中檢測到ROS含量的異常升高。

尋找抑制髓核細胞凋亡、炎癥及氧化應激反應的藥物，對抑制椎間盤退變具有重要意義。TFG為銀杏葉中的活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗細胞凋亡等多種藥理作用。樊麗超等[8]發現TFG可抑制脂多糖誘導的小膠質細胞炎癥反應及活化進程，推測TFG可能通過抑制炎癥反應，緩解神經系統炎癥損傷。Arab-Nozari等[12]發現銀杏葉提取物中的TFG可通過抑制氧化應激、炎癥反應，保護肝臟細胞凋亡。但TFG是否對髓核細胞凋亡有保護作用還未見報道。本研究發現，隨著TFG濃度的升高，IL-1β刺激下的髓核細胞增殖活性逐漸升高，在80～160mg/mL時達到穩定水平，且與IL-1β誘導組比較，TFG低、高劑量組髓核細胞增殖活性升高，并伴隨著凋亡率、凋亡蛋白cleaved caspase-3、炎癥因子TNF-α及氧化應激指標ROS含量的降低，提示TFG也可抑制髓核細胞凋亡，其抑制作用可能與抑制髓核細胞氧化應激、炎癥反應有關。但其具體分子生物學機制還需進一步研究。

Nrf2/ARE通路與機體抗氧化、抗應激及抗凋亡關系密切，并越來越受到臨床疾病研究的重視。Jiang等[13]研究發現氧化應激反應或代謝產物ROS可刺激Nrf2與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Keap1)解聚，促進Nrf2轉位入核與ARE結合，激活ARE下游抗氧化酶基因如HO-1的表達，進一步增強細胞清除ROS能力并抑制巨噬細胞活性，發揮抗氧化、抗炎作用。常洪澤等[14]發現Nrf2/ARE通路可作為細胞重要的防御機制，參與髓核細胞炎癥、自噬及氧化應激過程，并推測Nrf2/ARE通路有望成為防治椎間盤退變的新靶點。本研究發現，IL-1β誘導組髓核細胞凋亡過程中，Nrf2入核數目增多，ARE蛋白及其下游蛋白HO-1表達水平升高，而Nrf2/ARE通路抑制劑Brusatol可使得Nrf2入核數目減少，ARE及其下游HO-1蛋白表達減少，細胞增殖活性降低，凋亡率、cleaved caspase-3、TNF-α蛋白及ROS含量升高，提示炎癥刺激狀態可誘導Nrf2/ARE激活，抵抗炎癥反應及氧化應激損傷細胞，但這種激活不足以抵抗炎癥及氧化應激引起的細胞凋亡，且抑制Nrf2/ARE激活可加重氧化應激及炎癥損傷，加速髓核細胞凋亡。本研究采用TFG處理后，細胞Nrf2入核數目、ARE及其下游蛋白HO-1表達也顯著升高，細胞表現出更高的增殖活性及較低的凋亡水平，且上述作用可被Brusatol逆轉，提示TFG抑制髓核細胞凋亡作用可能與促進Nrf2/ARE激活有關。

綜上所述，TFG可通過激活Nrf2/ARE通路，發揮抗炎、抗氧化、抗髓核細胞凋亡作用，為闡明髓核細胞凋亡及腰椎間盤退變的分子生物學機制提供一定理論依據，但髓核細胞凋亡的分子機制復雜，且途徑較多，TFG抑制髓核細胞凋亡的其他途徑還有待進一步探究。