氣管植入間充質干細胞聯合部分液體通氣對海水淹溺致肺損傷大鼠治療作用的研究

張春陽 李亮 張寧坤

海水淹溺可導致肺組織損傷，嚴重者出現急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)，死亡率高。傳統的治療方法，如常規機械通氣、高壓氧等，不能有效的促進局部損傷細胞修復、阻止ARDS的病理進程，未從根本上解決肺泡/毛細血管膜受損的問題[1-2]。有研究發現，部分液體通氣可減輕ARDS所導致的肺泡萎陷，同時作為液體通氣的介質-全氟化碳(perfluorocarbon，PFC)具有降低炎癥反應的作用[3]。而間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有修復損傷、自動歸巢、免疫調節的作用，有可能針對肺泡/毛細血管膜受損，減輕海水淹溺導致的肺損傷[2]。目前國內外尚無將兩者聯合，用于海水淹溺導致的肺損傷及急性呼吸窘迫綜合征治療的研究報道。因此，本研究擬通過氣管內植入臍帶來源的間充質干細胞聯合部分液體通氣，觀察對海水淹溺致大鼠肺損傷的治療效果，以探索新的救治手段。

資料與方法

一、主要試劑及材料

DMEM/F12(dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12)培養基(美國Hyclone公司)；胰蛋白酶(Trypsin)(美 國Invitrogen公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(美國 Gibco 公司)；全氟化碳(上海捷視醫療設備有限公司)；CM-Dil 細胞標記液(Molecular Probes,C7000)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6, IL-6)、白介素-10(Interleukin-10, IL-10)ELISA試劑盒(天津安諾瑞康生物技術有限公司，中國)。配置海水 參考前期研究[4]，采用海水配方，海水成分：NaCl 26.518 g/L, MgCl22.447 g/L, MgSO43.305 g/L, CaCl21.141g/L, KCl 0.725 g/L，NaHCO30.202 g/L, NaBr 0.083 g/L, 滲透壓濃度 1250～1350 mmol/L, PH 8.2, 比重 1.05～1.06。SPF級健康雌性SD大鼠(北京科宇動物養殖中心)，鼠齡(2.5±0.5)月，體重(300±30)g,許可證號：SCXK(京)2018-0010。

二、方法

1. 間充質干細胞分離、培養、傳代及熒光標記: 經倫理委員會批準(NO.HZKY-PJ-2015-1)，簽訂知情同意書后，無菌條件下留取臍帶組織。參考既往研究[5]，采用組織塊貼壁法，分離、培養臍帶華通膠間充質干細胞，已對其分化及免疫表型進行檢測，符合MSCs標準。取長勢良好的第 3 代MSCs， 經0.25% 胰蛋白酶消化， PBS 洗滌離心后，棄上清，用空白細胞培養液制成1×106/mL的細胞懸液; 每毫升細胞懸液加5μl 的 CM-Dil 細胞標記液，輕柔地吹打混勻; 37 ℃孵育5 min或更短的時間，然后于4 ℃再孵育15 min。離心 5 min; 棄上清，DMEM重懸細胞沉淀; 再次孵育離心，重復2次，繼續培養;觀察標記情況。

2. 實驗動物分組： 將大鼠分為5組：CONTROL組(C組)、MODEL組(M組)、REGULAR組(R組)、PFC組(P組)和PFC+MSC組(PM組)，每組6只大鼠。

3. 構建模型：大鼠給予腹腔注射10%水合氯醛(0.35mL/100mg)麻醉，固定于鼠板，組織剪暴露頸部肌肉，鈍性分離，暴露氣管，并分離右側頸動脈置管，供留取血氣分析使用。氣管切開后，使用1mL注射器，連接改良自腰椎穿刺麻醉用軟導管，插入大鼠氣道內1.5cm左右，緩慢注射配方海水(4mL/kg)，時間約15 min，之后予以經氣管切開處氣管插管，連接呼吸機。于頸動脈留置動脈導管，于1h、3h抽取動脈血氣分析。除C組外，其余各組給予氣管切開后注入4 mL/kg海水。

4. 常規機械通氣及部分液體通氣: 除C和M組外，其余各組予以氣管插管，R組給予常規機械通氣，P組給予部分液體通氣(參照研究[6]，按2 mL/kg氣管內注入PFC)，PM組給予氣管內植入100μl含1×106MSCs的PBS后，予以部分液體通氣(同P組)，以上機械通氣，均采用CMV模式，呼吸頻率80次/分，潮氣量10mL/Kg，給氧濃度100%。

5. 監測指標: 監測大鼠呼吸、心率、血氧飽和度變化；造模后1h和3h測定大鼠動脈血氣血氧分壓(PaO2)，計算氧合指數(動脈血氧分壓/吸氧濃度，PaO2/FiO2)。

6. 標本的采集和處理: 麻醉后5mL注射器動脈穿刺置管放血處死大鼠，注入抗凝管后離心留取血清，-80℃凍存。組織剪剪開胸腔，充分暴露心臟及肺臟，眼科剪小心將雙肺游離，立即放入冷0.9%生理鹽水中，洗凈殘留血，吸水紙吸干后，觀察肺大體表現。留取左肺葉置于10%的甲醛；余按右肺上葉、右肺中葉、右肺下葉，分別放入錫紙內包裹，標記信息后，立即放入液氮中保存。

7. 大鼠肺組織病理學檢查: 左肺葉標本石蠟包埋，切片行H&E染色染色。光鏡下觀察，各組病理學的變化。

8. 觀察大鼠肺組織內MSCs分布: 預冷恒冷箱切片機，設定在-18℃左右；將右肺上葉標本自液氮取出后，留取約1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小的標本，加入OCT包埋劑；冷凍切片，5μm厚度，切片附著于潔凈載玻片上，激光共聚焦顯微鏡，觀察肺組織標本中表達紅色熒光的MSCs表達情況。

9.ELISA法檢測: 采用相應的試劑盒檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量變化。

三、統計分析

結 果

一、間充質干細胞形態及熒光標記

光鏡下觀察第4代間充質干細胞，可見細胞呈梭形，平行排列(見圖1)。加入CM-DIL染料后，光鏡下可見間充質干細胞呈梭形或多角形，更換熒光后，可見細胞發出紅色熒光，提示CM-DIL標記細胞(見圖2)。

圖1 光鏡下觀察間充質干細胞 (40×)

圖2 間充質干細胞CM-DIL標記(A:CM-DIL標記的間充質干細胞，紅色熒光；B：光鏡下觀察間充質干細胞 100×)

二、大鼠一般狀況

M組大鼠氣管內灌注海水后，立即出現呼吸頻率增快、心率增快，偶有嗆咳，并出現呼吸加深、屏氣現象，氣道內有白色泡沫樣滲出物，可聞及氣道喘鳴音。監測氧飽和度迅速下降。

三、動脈血氣

氧分壓PaO2變化：海水灌注大鼠氣管后，1h時間點，M組較C組、R組、P組和PM組明顯下降,PM組與C組比較，差異有統計學意義(H=25.062,P=0.032)。R組、P組和PM組較M組升高，P組和PM組與M組分別比較，差異有統計學意義(H=25.062,PvsM:P=0.001,PMvsM:P<0.001)。R組、P組和PM組水平依次升高，但兩組之間分別比較，差異無統計學意義(H=25.062,P>0.05)。3h時，M組、R組、P組和PM組分別與C組比較，差異有統計學意義(F=659.461,P<0.001)。R組、P組和PM組分別與M組比較，差異有統計學意義(F=659.461,P<0.001)。P組高于R組，差異有統計學意義(F=659.461,P=0.046)，PM組高于R組，差異有統計學意義(F=659.461,P=0.012)。PM組水平均輕度高于P組，兩者之間無統計學差異(F=659.461，P>0.05)(見表1)。

表1 大鼠動脈血氣分析氧分壓(mmHg,n=6)

氧合指數PaO2/FiO2變化：在海水灌注后，1h和3h時間點，M組、R組、P組和PM組低于C組，兩組間分別比較，差異有統計學意義，(1h:F=77.579,P<0.001；3h:F=74.000,P<0.001)；M組較R組、P組和PM組明顯下降，差異有統計學意義(1h:F=77.579,P<0.001；3h:F=74.000,P<0.001)。P組和PM組分別與R組比較，在1h時間點兩組之間分別比較，差異有統計學意義(F=77.579,PvsR:P=0.013,PMvsR:P=0.005)；在3h時間點比較，雖分別高于R組，但差異無統計學意義(P>0.05)。P組與PM組兩者分別在1h、3h比較，PM組雖輕度高于P組，但兩者差異無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 大鼠氧合指數(mmHg/%,n=6)

四、肺組織形態學變化

C組雙肺組織呈粉紅色，未見腫脹及充血改變。M組大鼠肺組織腫脹明顯，呈蒼白色，表面可見大面積片狀出血，局部可見大小不等暗紅色點片狀實變。R組與C組比較，未出現明顯蒼白腫脹表現，但局部可見片狀出血及暗紅色實變樣改變。P組及PM組大鼠肺組織表面片狀出血及暗紅色點片狀實變較M組和R組少。PM組較P組大鼠肺組織表面片狀出血面積及暗紅色點片狀實變減少(見圖3)。

圖3 大鼠肺組織形態

五、大鼠肺組織病理變化(HE染色)

光鏡下可見，C組大鼠肺泡組織結構完整，肺泡壁薄，肺間質未見增厚，肺泡腔內未見水腫。M組可見肺組織內充血明顯，并可見大量炎性細胞滲出，局部可見肺泡萎陷，失去正常結構，部分肺泡腔內可見大量紅細胞，肺泡間隔明顯增寬、增厚。R組、P組及PM組較M組減輕，其中P組和PM組損傷減輕更加明顯，肺泡間隔較R組增寬、增厚減少，肺泡萎陷數量減少(見圖4)。

圖4 大鼠肺組織病理(A:C組，B：M組；C：R組；D：P組；E:PM組，HE染色 20×)

六、ELISA檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表達

血清IL-1β表達，M組、R組均高于C組，差異有統計學意義(H=26.908,MvsC:P<0.001，RvsC:P=0.01)。P組和PM組水平高于C組，但各自兩者之間比較無統計學差異(P>0.05)。R組、P組和PM組水平低于M組，PM組與M組比較，差異有統計學意義(H=26.908,P=0.004)，R組和P組分別與M組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。R組、P組和PM組的IL-1β表達水平依次下降，但兩者之間分別比較，差異無統計學意義(P>0.05)(見表3)。

表3 大鼠海水淹溺血清細胞因子(pg/mL，n=6)

血清IL-6表達，M組、R組、P組和PM組均較C組顯著升高，差異有統計學意義(F=231.683,P<0.001)。R組、P組和PM組與M組比較，各組均表達降低，兩組之間分別比較，差異有統計學意義(F=231.683,P<0.001)。P組和PM組水平均分別低于R組，兩組之間分別比較，差異有統計學意義(F=231.683,PvsR:P<0.001,PMvsR:P<0.001)。PM組水平低于P組，差異有統計學意義(F=231.683,P=0.004)(見表3)。

血清IL-10表達，M組、R組、P組和PM組均較C組顯著升高，差異有統計學意義(F=85.451,P<0.001)。R組和PM組水平高于M組，兩組之間分別比較，差異有統計學意義(F=85.451,RvsM:P=0.035，PMvsM:P<0.001)。P組水平高于M組，但差異無統計學意義(P>0.05)。P組表達水平低于R組，但差異無統計學意義(P>0.05)。PM組水平均高于R組和P組，兩組之間分別比較，差異有統計學意義(F=85.451,PMvsR:P=0.003，PMvsp:P<0.001)(見表3)。

血清TNF表達，M組、R組、P組和PM組均較C組升高，M組與C組分別比較，差異有統計學意義(H=24.882,P=0.004)，而R組、P組和PM組與C組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。R組、P組和PM組與M組比較，表達水平均低于M組，R組和P組分別與M組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，PM組與M組比較，差異有統計學意義(H=24.882,P<0.001)。P組和PM組表達水平低于R組，P組與R組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，PM組與R組比較，差異有統計學意義(H=24.882,P=0.016)。PM組水平低于P組，但差異無統計學意義(P>0.05)(見表3)。

七、外源性MSCs在大鼠肺組織內分布及分化表達

通過激光共聚焦顯微鏡觀察PM組大鼠肺組織冰凍切片，可發現通過CM-DIL標記的紅色熒光表達的MSCs(圖5)。

圖5 激光共聚焦顯微鏡觀察大鼠肺內間充質干細胞(A:CM-DIL ；B: DAPI；C: MERG, 100×)

討 論

目前國內外尚無關于通過氣道植入間充質干細胞聯合部分液體通氣治療肺損傷的報道。PFC與MSCs直接接觸，因PFC脂溶性、比重大等特征，對MSCs的活力及遷移均有著影響[8]。通過前期體外模擬試驗中發現，不能直接將MSCs加入PFC中進行試驗，而先加入MSCs，后加入PFC時，PFC對MSCs的細胞遷移、細胞增殖及分化能力未受明顯影響。因此本研究采用先氣管內植入間充質干細胞，之后灌注全氟化碳，進行部分液體通氣。

本研究采用人工配方模擬海水，在氣管內注入后，大鼠動脈血氣分析提示氧合指數在造模后的1h和3h，均小于300mmHg，說明構建的大鼠海水淹溺模型可保持肺損傷導致缺氧狀態。通過監測動脈血氣分析及測算氧合指數，提示聯合治療同單獨部分液體通氣，同樣可較快改善海水淹溺后大鼠的動脈血氧分壓及氧合指數，并維持至造模觀察終點3h。這一方面與PFC較高的氧溶解能力有關，另一方面因PFC比重大，可使損傷較重的肺泡萎陷區域復張，抑制海水灌注引起的肺泡腔炎性滲出，使肺內血流重新分布，從而改善通氣/血流比值有關[8]。同時肺組織病理也證實，部分液體通氣及聯合干細胞治療組可明顯減輕肺泡損傷，維持正常結構。

研究表明，肺內過度和失控的炎癥反應是導致ARDS的根本原因，其中TNF-α、IL-1β和IL-6均與ARDS發生、發展密切相關[1]。TNF-α、IL-1β是全身及局部炎癥反應中起到重要作用的細胞因子，參與炎癥級聯反應[9]。IL-10作為抗炎細胞因子被發現具有抑制NF-kB活化的功能，其變化是機體抗炎反應的之一[9]。本研究在海水灌注后，大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6均顯著升高，提示機體對于海水淹溺出現全身炎癥反應。同時IL-10也同時升高，作為機體對過多炎癥因子釋放的反應，屬于機體的負反饋調節。針對肺損傷機體過度炎癥反應，本研究中部分液體通氣聯合氣道植入間充質干細胞組和部分液體通氣組，較常規通氣治療減輕了TNF-α、IL-1β和IL-6的升高，其中聯合治療組更加明顯。考慮與PFC和MSCs均具有抗炎作用有關[10]。已有大量研究證明，MSCs具有免疫調節、抑制炎癥反應的作用，并已在肺損傷的多種動物模型中被證實[11-12]。作為抗炎因子的IL-10，在聯合治療組較其他組升高更加明顯，這有可能與MSCs通過免疫調節作用，參與機體對炎癥反應的調控有關。

針對解決ARDS中肺泡/毛細血管膜受損的問題，本研究提出利用MSCs修復損傷的這一特點進行嘗試。研究中可觀察到大鼠肺組織內可見紅色熒光標記的MSCs，提示通過氣管植入的外源MSC可順利植入肺組織內。因本研究未進行長時間的觀察，需要后續研究觀察植入MSCs在修復損傷方面所起到的作用。

總之，本研究首次發現氣管植入間充質干細胞聯合部分液體通氣，較常規機械通氣及部分液體通氣可更好的改善和維持氧合，減輕海水淹溺導致的肺組織損傷，并可更有效的減少細胞因子表達水平，這為研究救治海水淹溺致急性呼吸窘迫綜合征的方法，提供了新的思路和理論基礎。