基于網絡藥理學與分子對接探討雞血藤-桑寄生治療糖尿病周圍神經病變的分子機制

侯亞威 李亞蒙 徐玉坤 肖振衛

1.山東中醫藥大學中醫學院，山東濟南 250000；2.山東中醫藥大學附屬醫院老年醫學科，山東濟南 250000；3.山東中醫藥大學附屬醫院腎病科，山東濟南 250000

糖尿病周圍神經病變（diabeticperipheralneuropathy，DPN）是糖尿病最常見的并發癥之一，主要以手腳或腿疼痛、感覺異常為特征，并伴有周圍神經病變[1]。炎癥介質、代謝異常及神經元活性與DPN 的發病機制密切相關，DPN 的治療可能涉及到多種聯合治療，其中包括控制血糖水平和疼痛，研究者們一直尋求治療DPN 最有效的手段[2]。

DPN 在中醫屬消渴病中“痹癥”范疇，認為此病病機多為“氣虛血瘀”，同時，多年臨床實踐發現雞血藤-寄生在改善DPN 患者的疼痛狀態及感覺異常方面效果顯著，查閱資料發現，桑寄生-雞血藤亦是祝諶予老師之經驗伍用，其與降糖藥參合，屢見奇效[3]。雞血藤，味苦微甘，性溫，歸肝經，能夠補血活血、舒筋絡；桑寄生，味苦甘，性平，可補肝腎，強筋骨；二者伍用，補肝腎、強筋骨、通絡之力加強[4-5]。

中藥方劑治療疾病在網絡藥理學中具有多成分、多靶點、多通路的特點，現運用網絡藥理學技術探索雞血藤-桑寄生治療DPN 的分子機制，并通過分子對接進行驗證。

1 材料與方法

1.1 藥物相關靶點的篩選

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）尋找2 味中藥化學組成成分，并進行ADME 篩選，按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 兩個閾值初步獲得藥物的有效活性成分及靶點，并通過TCMID 及中國知網、萬方搜集2017 年2 月至2020 年12 月的文獻補充未預測到的靶點，刪除未預測到的靶點成分，并在Uniprot 數據庫規范化合物作用的靶點[6-8]。

1.2 “藥物-活性成分-靶點”網絡圖構建

將藥物活性成分及靶點導入Cytoscape 3.7.2 中，構建“藥物-活性成分-靶點”網絡圖，并獲取藥物主要成分。

1.3 疾病相關靶點的篩選

在GeneCards 中挖掘DPN 的潛在靶點，根據學者經驗，設Score 值≥2 倍中位數的靶點為DPN 的潛在靶點[9]，并在TTD、DRUGBANK 中尋找DPN 靶點，刪除重復靶點。

1.4 藥物疾病交集靶點獲取及蛋白質-蛋白質相互作用分析（proteinprotein interaction，PPI）網絡構建

為明確藥物-疾病靶點間的相互作用，利用R 語言繪制維恩圖，獲取交集靶點，通過STRING 數據庫進行PPI 分析，獲得PPI 網絡，借助Cytoscape 3.7.2，對PPI 網絡進行拓撲分析及可視化，并獲取核心靶點[10]。

1.5 GO 與KEGG 分析及其可視化

將核心靶點導入Metascape 平臺，完成GO 及KEGG 分析，通過生物信息平臺對結果進行可視化分析[11]。

1.6 “藥物-成分-通路-靶點”網絡圖構建

通過Cytoscape 3.7.2 構建“藥物-成分-通路-靶點”網絡圖，根據度值獲取雞血藤-桑寄生治療DPN發揮作用的核心成分及通路。

1.7 分子對接驗證

為進一步驗證“1.6”中核心成分及其靶點在能量和結構上匹配程度，依據TCMSP 獲取化合物小分子2D 結構，采用ChemDraw、Chem3D 獲得化合物小分子的3D 結構，運用Pymol，對其進行去水、移除靶蛋白中的配體。從RCSBPDB 中獲取靶蛋白的3D 結構。采用AutoDockTools，設置其活性口袋，運行Autodockvina 進行分子對接，并采用PyMol 進行結構匹配及可視化分析[12]。

2 結果

2.1 藥物靶點的獲取

初步獲得化學成分：雞血藤68 種、桑寄生46 種，經ADME 篩選后共獲得活性成分：雞血藤23 種、桑寄生2 種，見表1。雞血藤靶點426 個、桑寄生靶點157 個，刪除重復靶點共得到178 個靶點。

表1 藥物主要成分

2.2 “藥物-活性成分-靶點”網絡圖構建

“藥物-活性成分-靶點”網絡圖，共得到203 個節點，456 條邊，橢圓形代表靶點，菱形代表活性成分，三角形代表藥物。見圖1。

圖1 “藥物-活性成分-靶點”網絡圖

2.3 疾病靶點的獲取

在GeneCards 數據庫獲得疾病靶點4778 個。該靶點Score 中位數為5.54，故設定Score 值≥11.8 的靶點為DPN 的潛在靶點。結合TTD、OMIM、DRUGBANK補充靶點，刪除重復值，得到1199 個靶點。

2.4 維恩圖及PPI 網絡構建

藥物靶點及DPN 靶點篩選后取交集，繪制緯恩圖，得到78 個交集靶點，見圖2。PPI 網絡共有1413 條邊，見圖3。對PPI 網絡進行拓撲分析，得到64 個核心靶點，見圖4。

圖2 “藥物-疾病”維恩圖

圖3 蛋白質-蛋白質相互作用網絡分析

圖4 蛋白質-蛋白質相互作用拓撲分析

2.5 GO 與KEGG 分析

通過Metascape 平臺對“2.4”中核心靶點進行通路信號分析，以富集分析的中位數為依據，GO 中生物過程（biological process，BP）選取25 個、GO 的細胞成分（cell componcnt，CC）選取10 個、GO 的分子功能（molecular furction，MF）選取9 個進行富集三合分析，見圖5。KEGG 選取22 條通路進行可視化，見圖6（封四）。

圖5 核心靶點GO 分析

圖6 KEGG信號通路氣泡圖

2.6 “藥物-成分-通路-靶點”網絡圖構建

借助Cytoscape 3.7.2 繪制“藥物-成分-通路-靶點”網絡圖，對“2.5”中KEGG通路進一步分析，該網絡有66 個節點，118 條邊，方形代表靶點，菱形代表成分，橢圓形代表通路，三角形代表藥物，并根據度值發現TP53、EGFR、ESR1（度值分別為12、10、4）為主要核心靶點及其成分、通路。見圖7。

圖7 “藥物-成分-通路-靶點”網絡圖

2.7 分子對接結果

“2.6”中主要核心靶點與其成分對接結果所示，槲皮素、木犀草素、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮與相應靶點都具有較好的親和力，具體見表2，對接模式見圖8。

圖8 分子對接模式圖

表2 分子對接結合能

3 討論

雞血藤作為常用的活血通絡藥，亦為“血分圣藥”，具有抗炎、抗氧化等功效；桑寄生具有神經保護、降血糖等作用；DPN 的發生發展是氧化應激、糖脂類代謝異常、JAK-STAT 信號通路維持機體內環境的穩定失調及雪旺細胞的病變等綜合作用的結果[13-17]。

雞血藤、桑寄生主要活性成分為槲皮素、木犀草素、芒柄花黃素；王保江等[18]進行大鼠實驗發現槲皮素能夠改善四氧嘧啶所致的DPN；施建豐等[19]發現木犀草素可能通過改變巨噬細胞的極性從而調節炎癥介質的表達；木犀草素能夠在各種神經退行性變中降低氧化應激[20]。

PPI 網絡拓撲分析闡釋蛋白互作關系，并篩選出64 個核心靶點，結合GO 分析，其中EGFR 屬于酪氨酸激酶受體，EGFR 二聚自磷酸化后主要引導下游MAPK、JAK-STAT 及PI3K-Akt通路磷酸化，調控脂多糖引起的炎癥、細胞凋亡及氧化應激反應；PARP1 上調則細胞存活，抑制PARP1 則誘導細胞凋亡；ESR1調控內分泌系統、甲狀腺激素的分泌；TP53通過磷酸化調節其活性，通過調控下游MAPK、PI3K-Akt、Wnt 等通路參與調控細胞周期、調節上游代謝基因表達、促進DNA 修復基因轉錄等生物學過程[21-23]。

KEGG中選取MAPK、JAK-STAT、PI3K-Akt 等22 條信號通路分析，發現木犀草素與槲皮素通過MAPK信號通路調控氧化應激反應、炎癥反應;木犀草素、槲皮素干預的PI3K-Akt 信號通路參與葡萄糖的轉運、增殖、凋亡和分化等多種細胞功能；芒柄花黃素、毛蕊異黃酮通過內分泌抵抗、甲狀腺激素信號通路調控糖脂代謝，促進新血管生成的生物過程[24-26]。分析對接驗證中發現，活性成分與對應靶點均<-5 kcal/mol，研究者認為結合能<-5 kcal/mol 是分子對接時受體與配體穩定結合的標準，且結合能越低分子對接結合穩定性越高[27]；故活性成分與對應的靶點有較好的對接活性。

本研究探討雞血藤-桑寄生治療DPN 的分子機制，發現雞血藤-桑寄生主要通過EGFR、ESR1、PARP1等64 個與DPN 相關的潛在靶點，改善糖脂類代謝、保護神經元、調控細胞凋亡，且分子對接驗證了這一結果的可靠性，為臨床治療及研發新的藥物提供思路。