基于網絡藥理學探討化濁祛濕方預防動脈粥樣硬化的作用機制

陳興娟，王婷婷 ，胡 影，，李思明，侯承志，馮 玲

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是指血管內皮上的炎性因子侵襲、脂質沉積、血小板及白細胞等聚集、纖維組織增生而形成血栓斑塊，引起動脈管腔狹窄、閉塞，甚至破裂出血的病理過程[1]。AS是造成心腦血管疾病的主要原因，嚴重威脅人類的生命健康[2]。有效防治 AS 成為預防心腦血管疾病發生的關鍵。目前抗AS的治療主要通過他汀類降脂藥物進行干預，但其作為長期用藥的安全性備受關注。網絡藥理學是一種結合醫學、生物學、計算機科學、生物信息學等多學科基礎理論與研究手段，系統綜合地反映藥物對疾病網絡的干預機制[3]。這種研究方法與中醫藥復方的作用多靶點、多途徑有很大相關性，應用網絡藥理學梳理藥物靶點信息，尋找可能的作用機制，為中醫藥現代化研究提供了新的研究方法。中藥復方抗AS的作用受到越來越多的關注，化濁祛濕方是國醫大師路志正教授多年的臨床有效經驗方，前期研究顯示其具有一定的降脂和抗AS作用，為了闡釋其作用機制，本研究采用網絡藥理學方法，從化濁祛濕方的物質基礎出發，分析化濁祛濕方抗AS的分子機制，為后續課題研究提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1 化濁祛濕方相關靶點篩選 通過中醫藥系統藥理學平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)[4]找化濁祛濕方中6味中藥名稱，即紫蘇、厚樸、枳實、郁金、杏仁、茵陳的中藥化學組成成分，根據口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug likeness，DL)≥0.18的2個藥代動力學(ADME)屬性值進行初步篩選以獲得活性化合物及其作用的蛋白質靶點，并根據已發表的文獻報道補充未預測到的活性化合物的已知靶點。篩選結束后，統一在UniProt蛋白質數據庫(https://www.uniprot.org)將活性化合物作用轉化為標準名稱。

1.2 AS靶點篩選 通過TTD數據庫[5]、GeneCards(https://www.genecards.org/)、DisGeNET數據庫[6]等，以“Atherosclerosis”或“Arteriosclerosis”為疾病關鍵詞檢索潛在靶點。從DrugBank數據庫[7]尋找治療AS的西藥作用靶點進行補充。在GeneCards數據庫中，Score值越高表明該靶點與疾病聯系更密切。根據經驗，當靶點過多時則設定 Score大于中位數的目標靶點為AS的潛在靶點，合并4個疾病數據庫靶點后，刪除重復值得到AS靶點。

1.3 藥物及AS靶點共有靶點蛋白互作(PPI)網絡構建 為明確化濁祛濕方藥物及AS靶點之間的關系，通過Venny 2.1繪制蛋白韋恩圖，取交集靶點。將交集靶點提交至STRING 11.0數據庫[8]構建PPI網絡模型，將生物種類設定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設定為“highest confidence”(>0.9)，其余均為默認設置，得到 PPI 網絡之后將 STRING 平臺篩選出來的相互作用的蛋白基因輸入CytoScape 3.8.2軟件[9]的BisoGeNET插件中，篩選條件為Identifiers下選擇“homo sapiens(human)”“gene identifiers only”，Data Settings下只選擇“protein protein interaction”，進一步分析蛋白質的作用關系。

1.4 基因本體(GO)功能富集分析及京都基因組學百科全書(KEGG)通路的富集分析 通過將化濁祛濕方與AS共同的靶點錄入Metascape平臺[10](http://metascape.org/gp/index.html)，設置P<0.01，分析其主要的生物學過程與代謝通路并進行富集分析，GO功能分析主要用于描述基因靶點的功能，包括細胞功能、分子功能和生物功能。KEGG富集分析可以得到化濁祛濕方和AS共同靶點所富集的信號通路。保存數據結果并采用微生信云平臺對數據進行可視化處理。

1.5 構建化濁祛濕方-AS靶點-通路網絡圖 運用CytoScape 3.8.2構建化濁祛濕方-AS靶點-通路網絡，利用CytoScape 3.8.1內置工具分析有效成分及靶點的網絡拓撲參數，包括連接度(Degree)、介度(Betweenness)及緊密度(Closenesss)等，并根據網絡拓撲學參數判斷核心靶點及發揮藥效的主要活性成分。

2 結 果

2.1 化濁祛濕方活性成分靶點 通過TCMSP及中國臺灣中醫資料數據庫平臺，初步提取枳實化學成分65種，厚樸化學成分139種，郁金化學成分222種，紫蘇化學成分328種，杏仁化學成分113 種，茵陳化學成分 53種，經藥代動力學篩選后，共獲得具有作用靶點的成分66種，其中枳實18種、厚樸3種、郁金3種、紫蘇13種、杏仁16種、茵陳13種，包括厚樸新酚、新橙皮苷、黃酮等。在UniProt網站將上述成分轉換成標準基因靶點，得到枳實成分作用靶點121個，厚樸成分作用靶點38個，郁金成分作用靶點67個，紫蘇成分作用靶點93個，杏仁成分作用靶點67個，茵陳成分作用靶點180個，將所有藥物靶點進行合并后刪除重復值得到靶點共246個。詳見表1。

表1 化濁祛濕方藥物主要成分

(續表)

2.2 AS疾病靶點 在疾病靶點數據庫TTD、Genecards、DrugBank、DisGeNET查找檢索AS的疾病作用靶點，TTD數據庫篩選得到疾病靶點29個，DrugBank數據庫篩選得到疾病靶點47個，Genecards數據庫選擇Relevance score值大于6.69的疾病靶點279個，DisGeNET數據庫篩選得到疾病潛在靶點239個，4個數據庫合并去掉重復值，共獲得疾病靶點438個。

2.3 化濁祛濕方成分-AS靶點PPI網絡的構建 將篩選得到的化濁祛濕方活性成分靶點與AS疾病靶點取交集，并通過Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es)繪制韋恩圖，得到共同靶點80個。再將共同靶點提交至STRING 11.0平臺，在Setting里設置篩選條件“highest confidence(≥0.9)”，得到交集靶點的網絡圖，將STRING的結果以文本形成導入CytosCape 3.8.2軟件構建 PPI 相互作用網絡圖。詳見圖1～圖3。

圖1 化濁祛濕方-AS共同基因靶點

圖2 化濁祛濕方-AS靶點PPI網絡

圖3 化濁祛濕方-AS靶點相互作用PPI網絡

2.4 GO和KEGG通路富集分析 應用Metascape數據庫，將化濁祛濕方與AS共同基因靶點按照P<0.01進行GO和KEGG分析，結果顯示，生物過程(BP)相關條目1 693個，分子功能(MF)相關條目93個，細胞組成(CC)相關條目52個。可見多個靶點與脂質代謝相關，化濁祛濕方參與的生物學過程包括細胞對脂質應答(cellular response to lipid)、細胞黏附調節(regulation of cell adhesion)、膽固醇代謝過程(cholesterol metabolic process)、脂質生物合成過程的調控(regulation of lipid biosynthetic process)、胰島素分泌調節(insulin secretion)等；細胞主要涉及膜區、細胞外基質、胞質泡腔等方面。詳見圖4。

圖4 化濁祛濕方主要成分潛在靶點的GO富集分析

通過KEGG通路富集分析得到277條通路，以P<0.01 并結合相關文獻進行篩選，有59個和AS相關的通路，選取前20個通路輸入微生信網站(http://www.bioinformatics.com.cn)制作可視化富集氣泡圖，分析得出，可能發揮作用的通路集中在AGE-RAGE 信號通路、白介素-17(IL-17)信號通路、低氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號途徑、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路、Toll樣受體通路、脂肪細胞中脂肪分解的通路等。詳見圖5、表2。

圖5 化濁祛濕方KEGG通路氣泡圖

表2 化濁祛濕方調治AS靶點通路富集結果

(續表)

2.5 化濁祛濕方-AS靶點-通路網絡圖的構建 將以上共有靶點和所獲得的通路靶點建立network和type文件，運用CytoScape 3.8.2構建化濁祛濕方成分-AS靶點-通路網絡，通過CytoScape 3.8.2內置的NetworkAnalyzer分析化濁祛濕方治療AS網絡拓撲學參數，得到核心成分及核心作用靶點。Cytoscape網絡分析結果顯示，槲皮素連接度為55，介度為0.295，緊密度為0.554，預測槲皮素為化濁祛濕方治療AS的主要成分，其次為木犀草素(連接度為21，介度為0.032，緊密度為0.442)、柚皮素(連接度為19，介度為0.068，緊密度為0.432)，川陳皮素(連接度為13，介度為0.026，緊密度為0.420)。環氧合酶-2(PTGS2)在網絡中的連接度為58，介度為0.336，緊密度為0.579，預測PTGS2為化濁祛濕方治療AS的最主要靶點，SCN5A、MAPK14、NOS2、ESR1、PPARG、IL6、MAPK1、TNF、MAPK8、AKT1、PIK3CG、IL1B等也為重要作用靶點。詳見圖 6、表3。

圖6 化濁祛濕方-AS-通路

表3 化濁祛濕方主要活性成分網絡節點特征參數

3 討 論

化濁祛濕方是國醫大師路志正在臨證多年總結的有效經驗方，在治療AS時重在調節中焦脾胃，采用運脾化濁法治療血脂異常[11]。脾以健運為主，脾運失常，中焦運化失宜，則痰濁易生，痰濁瘀滯于血脈，形成AS。因此，路志正教授提出通過調節中焦脾運，以“持中央、納化常”的治療思想，調節中焦脾胃運化功能，使痰濁無以生，血脈調和，則病無所生[12-13]。

本研究通過網絡藥理學方法分析了化濁祛濕方抗AS的活性成分為槲皮素、木犀草素、柚皮素、川陳皮素等。槲皮素是茵陳的有效成分，屬于天然黃酮類，已有研究揭示了其抗炎、抗癌、抗氧化和抗凋亡活性。有研究表明，槲皮素通過 ROS 調節的 PI3K/AKT 信號通路抑制炎癥和凋亡，從而減輕高果糖喂養誘導的AS[14]。槲皮素以濃度依賴的方式增強巨噬細胞中膽固醇外流與 ABCA1 mRNA及其蛋白質的表達，并且可能通過SCAP-SREBP2-LDLr信號通路改善脂質代謝[15-16]。木犀草素是枳實和紫蘇共有的有效成分，木犀草素能通過AMP活化蛋白激酶(AMPK)-Sirtuin(SIRT)1信號傳導降低氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的人單核細胞(THP-1)來源的巨噬細胞中總膽固醇水平，同時能抑制巨噬細胞趨化因子和炎性細胞因子表達[17]。柚皮素是郁金和枳實共有的有效成分，柚皮素可抑制脂肪生成并降低脂肪細胞中胰島素敏感性和脂聯素的表達[18]。

本研究通過GO功能分析和KEGG通路富集解析化濁祛濕方抗AS的分子機制。應用Metascape數據庫KEGG通路分析結果表明，化濁祛濕方的潛在機制主要與AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號途徑、MAPK通路、TNF信號通路、核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路、PPAR信號通路、Toll樣受體通路、脂肪細胞中脂肪分解的通路等密切相關。PPI網絡顯示化濁祛濕方中有效成分可能是通過PTGS2、PPARG、IL6、MAPK1、TNF、MAPK8、AKT1、PIK3CG、IL1B等共有靶點網絡起作用。以上多個通路和靶點與脂質代謝、炎癥因子等相關。炎癥反應在AS病理發展過程中起著基礎性作用[19]。AGE/RAGE 信號傳導通路能引起包括NADPH氧化酶、蛋白激酶C和MAPKs的多個細胞內信號途徑的激活，然后導致NF-κB活性增加[20-21]。核激素受體PPARγ(PPARG)主要促進脂肪生成和巨噬細胞分化，是脂肪形成過程的關鍵調節器[22]。PTGS2又稱為環氧合酶-2(COX-2)，而 COX-2 是花生四烯酸代謝過程中調節前列腺素合成的限速酶，主要參與機體的各種炎癥反應。TNF信號通路、NF-κB信號通路的激活對促進 AS 發生發展起著至關重要的作用[23]。TNF-α是血管內皮細胞損傷或導致血管功能紊亂的重要炎性因子，能夠激活誘導NF-κB進入細胞核，激活NF-κB信號通路，促使TNF-α、IL-6、IL-8 等炎性因子的釋放，從而引起和加重機體炎癥反應[23]。PPAR激活能通過抑制血管內皮炎性反應、細胞增殖和遷移、單核細胞轉化成泡沫細胞，減少血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達等多個方面，發揮抗AS作用，PPAR-α在調節脂肪代謝過程中，特別是降低ox-LDL的濃度有著重要作用[24-25]。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學對化濁祛濕方的主要活性化合物及藥理作用進行了初步研究，結果證實化濁祛濕方多個有效組分可作用于不同靶點，同時各個靶點參與不同的生物過程、分子功能和信號通路，充分體現化濁祛濕方可以起到抗AS的多靶點、多途徑、多通路的特點，為化濁祛濕方從分子生物學層面提供理論依據，也為化濁祛濕方后續實驗研究提供了方向。但限于網絡藥理學方法論的局限性以及中藥組分在煎煮時發生化學反應的復雜性，本研究未將化濁祛濕方煎煮后的化學成分以及化濁祛濕方活性成分在體內的代謝物納入分析。本研究主要是以生物信息學與海量數據計算的結果為基礎，后續將在此基礎上進一步篩選與動物或細胞實驗驗證，進而明確化濁祛濕方的主要調控靶點。