石菖蒲對腦梗死大鼠認知功能障礙及神經細胞凋亡的影響及機制探討

王彥平，張保朝，聞公靈，劉義鋒，汪 寧，孫 軍，茹 睿

腦梗死是因腦部血液循環障礙引起的局限性腦組織缺血、壞死或軟化，可引起顱內高壓、腦疝、昏迷，嚴重者可致死亡[1]。隨著溶栓及介入治療的不斷發展，腦梗死的死亡率下降，但多數病人仍遺留不同程度的認知功能障礙、失語、偏癱等神經功能缺失癥狀，不僅影響病人的生活質量，而且造成了一定的社會負擔[2]。因此，如何減少腦梗死后的神經功能缺失，改善認知功能障礙成為醫學研究熱點。石菖蒲是具有開竅益智、鎮靜安神作用的中草藥，在心腦血管疾病中有廣泛應用[3]。研究表明，石菖蒲中含有的揮發油、有機酸等成分具有抗氧化損傷、鎮靜、抗驚厥等作用，可保護癲癇大鼠腦神經細胞，改善認知功能障礙[4-5]。目前雖有研究證實石菖蒲有神經保護作用，但關于其在腦梗死中的應用及相關機制研究較少。本研究通過線栓法阻斷大腦中動脈建立腦梗死模型，觀察石菖蒲對腦梗死大鼠認知功能障礙及神經細胞凋亡的影響，以期為腦梗死藥物治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠60只，4周齡，體質量180～220 g，購自廣東省實驗動物監測所，生產許可證號：SCXK(粵)2018-0044，使用許可證號SYXK(粵)2016-0122。自然光線下飼養，12 h晝夜節律，溫度22～25 ℃，相對濕度50%～60%，自由進食水，實驗前適應性飼養1周。

1.2 實驗藥物、主要試劑和儀器

1.2.1 藥物 石菖蒲(北京同仁堂藥店，批號160503)，尼莫地平注射液(西南藥業股份有限公司生產，國藥準字H20064494)。

1.2.2 實驗試劑 兔抗大鼠糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)，磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)，β-連環蛋白(β-catenin)，p-β-catenin，促凋亡基因(B apoptosis cell matrixgene，Bax)，半胱天冬酶3(caspase-3，Casp3)多克隆抗體(美國Santa cruz公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(福州邁新生物技術開發有限公司)。

1.2.3 實驗儀器 OLYMPUS顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，Leitz1515型組織切片機(德國Leitz公司)，3550 UV酶標儀、7500實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀購自美國Bio-rad公司，Morris水迷宮(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司)。

1.3 腦梗死模型制備 采用改良Z-Longa線栓法造成大腦中動脈閉塞制作腦梗死模型，6 mL/kg 1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于手術臺上，頸部消毒備皮，沿正中線切開左側頸部皮膚，逐層分離各層組織，暴露頸總動脈、頸外動脈，結扎頸外動脈遠心端，微動脈夾夾閉頸內動脈和頸總動脈，于頸外動脈靠近頸總動脈分叉處剪一小口，將線栓自頸總動脈插入至顱內方向，深度18～20 mm至出現阻力，結扎線栓口下方，松開微動脈夾[6]。術后6 h實施Z-Longa評分法評價大鼠神經功能缺損情況，評分范圍1～6分，1～3分為模型制作成功[7]。

1.4 分組及干預 60只大鼠適應性飼養1周后稱重，隨機分為假手術組、模型組、陽性對照組、石菖蒲低劑量組、石菖蒲高劑量組，每組12只。除假手術組外均以改良Z-Longa線栓法阻斷大腦中動脈制作腦梗死模型，假手術組術中僅暴露頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，不阻斷大腦中動脈，其余方法相同。造模期間假手術組、石菖蒲高劑量組、陽性對照組各死亡1只，模型組及石菖蒲低劑量組各死亡2只，剔除死亡大鼠后，假手術組11只、模型組10只、陽性對照組11只、石菖蒲低劑量組10只、石菖蒲高劑量組11只進入后續實驗。

石菖蒲以雙蒸水浸泡4 h，水煎3次，每次煎煮120 min，混勻3次濾液，濃縮至1 g/mL，置于4 ℃冰箱備用。按照人與動物等效劑量換算，在神經功能缺損評價后石菖蒲低劑量組即以石菖蒲藥液0.6 g/kg灌胃，石菖蒲高劑量組以1.8 g/kg灌胃，陽性對照組以尼莫地平1 mg/kg灌胃，假手術組和模型組以生理鹽水10 mL/kg灌胃，每天1次，連續30 d。觀察藥物干預完成后大鼠的精神狀態、行走時肢體動作等行為學狀態。

1.5 水迷宮實驗評價大鼠認知功能 行為學觀察后實施水迷宮實驗，Morris水迷宮水池劃分為4個象限，在任意象限中心水面下1.5 cm處放置一平臺，距池壁20 cm，水中加入二氧化硅隱蔽平臺，水池周圍粘貼三角形圖片為參照線索，依次從4個象限入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄爬上平臺時間(逃避潛伏期)，超過60 s未找到平臺則引導大鼠爬上平臺，于平臺上停留20 s，逃避潛伏期為60 s。4個入水點每天各訓練1次，每一象限訓練間隔時間為20 min，隱蔽平臺實驗連續5 d，記錄第5天各組大鼠逃避潛伏期。第6天撤去平臺，任選1個入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄60 s內穿越平臺位置次數、目標象限停留時間百分比。

1.6 Tunel染色觀察梗死周邊組織神經細胞凋亡情況 水迷宮實驗結束后每組隨機選取5只大鼠，以4%多聚甲醛經頸總動脈灌流固定，取左側視交叉前后2 mm腦組織，常規石蠟包埋、切片，厚度4 μm，Tunel染色觀察梗死周邊組織神經細胞凋亡情況，陽染細胞核可見棕黃色顆粒。于顯微鏡下任選5個視野計數Tunel陽性細胞數。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測梗死周邊腦組織GSK-3β、β-catenin、Bax、Casp3 mRNA表達 各組剩余大鼠中選取5只，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后開胸，胸穿針自左心室刺入，灌入4 ℃生理鹽水，快速取出梗死半球腦組織，置于液氮中，保存于-80 ℃。腦組織在液氮中研磨，Trizol法提取總RNA，反轉錄獲得cDNA，瓊脂糖凝膠電泳法鑒定產物，實施實時熒光定量PCR，按照試劑盒說明書設定反應體系，反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。以GAPDH為內參基因，按照2-△△CT計算目的基因的相對表達量。引物序列詳見表1。

表1 引物序列

1.8 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、p-β-catenin、Bax、Casp3蛋白相對表達量 取-80 ℃保存的梗死灶腦組織，冰上裂解，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，100 ℃水浴10 min，制備蛋白上樣液，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉移至PVDF膜，加入封閉液室溫搖床2 h，加入封閉液稀釋一抗(1∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，加入封閉液稀釋二抗(1∶2 000)，常溫孵育1 h，暗室中曝光、顯影及定影。采用Image J軟件分析圖像進行灰度值分析，以目的蛋白灰度值與內參GAPDH灰度值比值表示蛋白相對表達量，并計算p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin。

2 結 果

2.1 各組大鼠行為學觀察 假手術組精神狀態良好，活動正常，無異常表現。模型組精神狀態不佳，活動量減少，對側肢體無力，行走時向對側傾斜、旋轉追尾，抬頭困難，豎毛，提尾倒立時身體向對側彎曲，重者癱瘓，無法自立性行走。陽性對照組存在抬頭困難、豎毛、身體向對側旋轉追尾等表現，神經功能損傷較模型組輕。石菖蒲低劑量組與陽性對照組行為學表現相同。石菖蒲高劑量組有輕度對側肌張力升高、豎毛、身體向對側傾斜等表現，神經功能損傷較石菖蒲低劑量組輕。

2.2 各組逃避潛伏期、穿越平臺次數、目標象限停留時間百分比比較 逃避潛伏期、穿越平臺次數、目標象限停留時間百分比組間比較，差異均有統計學意義(P<0.001)；與假手術組比較，模型組、陽性對照組、石菖蒲干預組逃避潛伏期延長，穿越平臺次數與目標象限停留時間百分比均減少，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和石菖蒲干預組逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數與目標象限停留時間百分比增加，差異均有統計學意義(P<0.05)；與陽性對照組和石菖蒲低劑量組比較，石菖蒲高劑量組逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數與目標象限停留時間百分比增加，差異均有統計學意義(P<0.05)；陽性對照組與石菖蒲低劑量組逃避潛伏期、穿越平臺次數、目標象限停留時間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組逃避潛伏期、穿越平臺次數、目標象限停留時間百分比比較(±s)

2.3 各組神經元凋亡情況比較 假手術組、模型組、陽性對照組、石菖蒲低劑量組、石菖蒲高劑量組凋亡神經細胞數分別為(6.20±1.32)個、(40.40±4.52)個、(33.60±3.20)個、(32.60±3.85)個、(15.40±2.80)個。神經細胞凋亡數組間比較，差異均有統計學意義(F=205.667，P<0.001)；與假手術組比較，模型組、陽性對照組、石菖蒲干預組凋亡細胞數更多，差異均有統計學意義(t值分別為23.907、25.870、21.567、9.986，P均<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和石菖蒲干預組凋亡細胞數更少，差異均有統計學意義(t值分別為4.127、4.078、15.230，P均<0.05)；與陽性對照組比較，石菖蒲高劑量組凋亡細胞數更少，差異有統計學意義(t=13.790，P<0.05)；陽性對照組與石菖蒲低劑量組凋亡細胞數比較，差異無統計學意義(t=0.290，P=0.773)。Tunel染色結果見圖1。

圖1 大鼠梗死灶周圍組織神經細胞凋亡情況

2.4 各組GSK-3β、β-catenin、Bax、Casp3 mRNA相對表達情況 各組GSK-3β、β-catenin mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。各組Bax、Casp3 mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義(P<0.001)。與假手術組比較，模型組Bax、Casp3 mRNA相對表達量更高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和石菖蒲干預組Bax、Casp3 mRNA相對表達量更低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與陽性對照組和石菖蒲低劑量組比較，石菖蒲高劑量組Bax、Casp3 mRNA相對表達量更低，差異均有統計學意義(P<0.05)；陽性對照組與石菖蒲低劑量組Bax、Casp3 mRNA相對表達量比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組GSK-3β、β-catenin、Bax、Casp3 mRNA相對表達量比較(±s)

2.5 各組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相對表達量比較 各組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義(P<0.001)。與假手術組比較，模型組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相對表達量更高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和石菖蒲干預組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相對表達量更低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與陽性對照組和石菖蒲低劑量組比較，石菖蒲高劑量組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相對表達量更低，差異均有統計學意義(P<0.05)；陽性對照組與石菖蒲低劑量組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相對表達量比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表4、圖2。

表4 各組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相對表達量比較(±s)

圖2 各組Western Blot檢測GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、p-β-catenin、Bax、Casp3蛋白相對表達量

3 討 論

腦梗死的發生機制是血液成分改變，出現動脈粥樣硬化及血栓，血管狹窄或阻塞引起腦部供血障礙，腦組織發生急性缺血、缺氧，梗死病灶腦細胞因缺血、缺氧而水腫、壞死，并生成大量自由基，造成神經細胞凋亡，出現認知功能障礙、偏癱等神經功能缺損表現[8]。在腦梗死的治療中，如何抑制梗死病灶周邊缺血半暗帶的神經細胞凋亡，阻止病情的進一步發展是改善神經功能障礙的重要措施[9]。中藥在治療腦梗死方面有悠久的歷史，并積累了豐富的經驗，且隨著現代醫學的發展，其優勢逐漸被臨床認知。石菖蒲為有醒腦開竅作用的中草藥，在心腦血管疾病的治療中有廣泛應用，為腦梗死的藥物治療研究提供了新的方向。

石菖蒲是天南星科菖蒲屬植物石菖蒲的根塊莖，屬于芳香開竅類中藥，具有醒神益智、開竅醒腦、理氣活血、燥濕化痰等功效，主治因中風、牙關緊閉、眼合及手足拘攣癥[10]。石菖蒲的主要有效成分為揮發油β-細辛醚和丁香酚，有鎮靜、抗驚厥、抗抑郁、降血脂、抑制血小板聚集、抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種作用[11]。章程鵬等[12]研究顯示，石菖蒲能夠修復睡眠剝奪引起的大鼠海馬區神經細胞損傷，減輕炎癥反應，改善大鼠的記憶功能。體外實驗證實，石菖蒲能減少脂多糖誘導的人腦神經膠質細胞中一氧化氮濃度，抑制過氧化損傷，達到腦保護作用[13]。本研究結果顯示，干預后模型組大鼠精神狀態差，活動量少，且有行走時向對側傾斜，有旋轉追尾、抬頭困難、豎毛、癱瘓等顯著的神經功能缺損表現。陽性對照組及石菖蒲低劑量組神經功能缺損表現較模型組輕，石菖蒲高劑量組神經功能缺損狀態較低劑量組輕；與模型組比較，陽性對照組和石菖蒲干預組的逃避潛伏期更短、神經細胞凋亡數更少，穿越平臺次數與目標象限停留時間百分比增加；與陽性對照組及石菖蒲低劑量組比較，石菖蒲高劑量組的逃避潛伏期更短、神經細胞凋亡數更少，穿越平臺次數與目標象限停留時間百分比增加，說明石菖蒲可減輕腦梗死大鼠神經功能損傷，抑制神經細胞凋亡，改善認知功能障礙。

神經細胞凋亡是造成腦梗死認知功能障礙的主要原因，GSK-3β/β-catenin信號通路在神經細胞凋亡中發揮重要的轉導作用[14]。β-catenin是一種多功能蛋白，通過與細胞骨架的相互作用協助細胞對細胞外信號做出反應[15]。GSK-3β是β-catenin上游的關鍵酶，GSK-3β的磷酸化可使β-catenin的降解復合體失活，使β-catenin磷酸化，易位進入細胞核，與T細胞因子/淋巴增強因子結合，誘導細胞損傷及凋亡[16]。朱明等[17]研究發現，GSK-3β/β-catenin信號通路的激活可使大鼠海馬神經元細胞形態發生改變，造成認知功能障礙。Darshit等[18]研究發現抑制GSK-3β/β-catenin信號通路的激活可上調GAP43、Ngn1和NeuroD2基因轉錄，維持神經元存活。Casp3是細胞凋亡信號通路中的關鍵調節位點，Casp3的激活可進一步激活下游信號調節因子促進細胞凋亡[19]。Bax是細胞主要的凋亡基因，可通過增加線粒體膜及細胞膜脂質雙分子層的通透性，促進促凋亡因子進入細胞線粒體，誘導細胞凋亡[20]。本研究結果顯示，與模型組比較，陽性對照組、石菖蒲干預組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值，Bax、Casp3 mRNA及蛋白相對表達量降低；與陽性對照組及石菖蒲低劑量組比較，石菖蒲高劑量組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值，Bax、Casp3 mRNA及蛋白相對表達量降低，提示石菖蒲可抑制腦梗死大鼠認知功能障礙、阻止神經細胞凋亡，其機制可能與抑制GSK-3β/β-catenin信號通路的激活有關。

綜上所述，石菖蒲能改善腦梗死大鼠的認知功能障礙，抑制神經細胞凋亡，其機制可能與抑制GSK-3β/β-catenin信號通路的激活有關，為與石菖蒲相關的治療腦梗死認知功能障礙的藥物研發提供依據。