清心解瘀方調(diào)控巨噬細(xì)胞穩(wěn)定動脈粥樣硬化易損斑塊的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

賴潤民，劉啟予，鞠建慶，徐 浩

易損斑塊是指動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊中發(fā)展迅速、具有血栓形成傾向的不穩(wěn)定性高危斑塊，易成為急性心肌梗死、心臟驟停、惡性心功能衰竭等臨床不良事件發(fā)生的罪犯病變[1]。以巨噬細(xì)胞為首的炎性細(xì)胞廣泛參與AS的發(fā)生發(fā)展和易損斑塊的形成、破裂，促進急性心血管事件的發(fā)生。深入解析巨噬細(xì)胞在易損斑塊中的作用、探尋有效干預(yù)措施始終是AS防治研究的熱點和難點。

隨著對易損斑塊病理機制認(rèn)識的不斷深入，陳可冀院士領(lǐng)銜的科研團隊提出“瘀毒致變”是AS易損斑塊破裂并引發(fā)心血管事件的重要病因病機[2]。大量動物及細(xì)胞試驗進一步證實活血解毒中藥能夠通過調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化、自噬、凋亡等過程起到穩(wěn)定AS斑塊的作用[3]。清心解瘀方由黃芪、丹參、川芎、藿香、黃連組成，是針對冠心病“瘀毒”病因病機的代表方，由陳可冀院士治療心肌梗死的經(jīng)驗方愈梗通瘀湯化裁而來[4]。前期臨床及基礎(chǔ)研究證實，清心解瘀方可降低穩(wěn)定型冠心病病人的炎性因子水平、非致死性心肌梗死及“硬終點”事件發(fā)生率，并可通過調(diào)控巨噬細(xì)胞凋亡穩(wěn)定AS易損斑塊[5-7]。然而中藥具有多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點綜合調(diào)節(jié)的作用特點，清心解瘀方是否還可通過其他途徑調(diào)控巨噬細(xì)胞、穩(wěn)定易損斑塊，本研究擬運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進行初步探索。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分與潛在靶點篩選 利用北京蛋白質(zhì)組研究中心開發(fā)的生物信息學(xué)工具BATMAN-TCM平臺(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm)檢索清心解瘀方中藥物的活性成分，并預(yù)測活性成分作用的基因靶點。檢索參數(shù)設(shè)置為Score cutoff≥20，P<0.05。

1.2 易損斑塊巨噬細(xì)胞相關(guān)差異基因獲取 從Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載編號為GSE41571的基因芯片[8]，該芯片基因表達(dá)譜來自于利用激光顯微切割技術(shù)從人頸動脈組織中分離的富含巨噬細(xì)胞的易損/破裂斑塊和穩(wěn)定斑塊。使用R軟件中的Affy包對原始數(shù)據(jù)進行背景校正、歸一化處理和探針注釋。使用limma包對差異表達(dá)基因進行提取，利用Benjamini-Hochberg方法對P值進行校正并篩選出P<0.05的差異表達(dá)基因。

1.3 藥物-活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 獲得清心解瘀方活性成分潛在靶點基因及易損斑塊巨噬細(xì)胞靶點基因后，利用Excel表格取兩者交集并進行藥物成分靶點-疾病靶點映射，構(gòu)建藥物-活性成分-作用靶點矩陣，并利用Cytoscape 3.2.2軟件對矩陣網(wǎng)絡(luò)進行可視化。

1.4 基因富集分析 將獲得的作用靶點基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)庫(http：//metascape.org)進行基因富集分析[9]。以P<0.01，min overlap=3，min enrichment=1.5的參數(shù)設(shè)置，對獲取的靶點進行基因本體(GO)生物學(xué)過程富集分析和信號通路富集分析及可視化。

2 結(jié) 果

2.1 清心解瘀方調(diào)控巨噬細(xì)胞穩(wěn)定易損斑塊的活性成分和潛在作用靶點 經(jīng)BATMAN-TCM平臺檢索，共獲得清心解瘀方活性成分187個和活性成分對應(yīng)的潛在靶點基因1 686個；對GSE41571基因芯片進行差異表達(dá)基因分析，獲得易損斑塊巨噬細(xì)胞相關(guān)基因899個。將清心解瘀方靶點基因與差異表達(dá)基因取交集后，獲得清心解瘀方調(diào)控巨噬細(xì)胞穩(wěn)定易損斑塊的潛在作用靶點基因87個，具有調(diào)控巨噬細(xì)胞作用的活性成分110個，其中靶基因數(shù)目在10以上的活性成分15個。詳見表1。

表1 清心解瘀方調(diào)控巨噬細(xì)胞穩(wěn)定易損斑塊的主要活性成分

2.2 藥物-活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape 3.2.2構(gòu)建清心解瘀方調(diào)控巨噬細(xì)胞穩(wěn)定易損斑塊的“藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)圖共包含202個節(jié)點(5個藥物，110個活性成分，87個靶點基因)、591條邊。深綠色圓形節(jié)點代表藥物，黃色菱形節(jié)點代表活性成分，淺綠色三角形節(jié)點代表作用靶點。詳見圖1。

圖1 清心解瘀方調(diào)控巨噬細(xì)胞穩(wěn)定易損斑塊的“藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 基因富集分析 將87個靶點基因?qū)隡etascape進行富集分析，結(jié)果顯示清心解瘀方調(diào)控巨噬細(xì)胞穩(wěn)定易損斑塊主要涉及的GO生物學(xué)過程包括炎癥細(xì)胞的遷移和增殖、脂質(zhì)合成代謝、激素參與的代謝過程、細(xì)胞程序性凋亡和細(xì)胞吞噬的調(diào)節(jié)及平滑肌細(xì)胞增殖等，詳見表2；主要涉及的信號通路包括脂質(zhì)代謝、磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路、鐵死亡、炎癥細(xì)胞的遷移和細(xì)胞吞噬等，詳見表3。

表2 清心解瘀方調(diào)控巨噬細(xì)胞穩(wěn)定易損斑塊涉及的主要GO生物學(xué)過程

表3 清心解瘀方調(diào)控巨噬細(xì)胞穩(wěn)定易損斑塊涉及的主要信號通路

3 討 論

易損斑塊除具有脂質(zhì)核心大、纖維帽薄、平滑肌細(xì)胞和膠原含量少等特點外，炎性細(xì)胞和炎癥介質(zhì)水平亦較高。脂質(zhì)沉積造成AS管腔狹窄與中醫(yī)藥學(xué)有關(guān)“瘀血”“血脈不通”的認(rèn)識有相似之處，而AS炎癥反應(yīng)及在此基礎(chǔ)上導(dǎo)致易損斑塊破裂合并血栓形成過程中所涉及的血管內(nèi)皮損傷、組織壞死及炎癥介質(zhì)等病理產(chǎn)物，均與中醫(yī)毒邪學(xué)說的內(nèi)毒或外毒密切相關(guān)[10]。在此基礎(chǔ)上，大量臨床及基礎(chǔ)研究進一步證實了中藥對巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)控作用[11]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探索了針對冠心病“瘀毒”病因病機的代表方清心解瘀方調(diào)控巨噬細(xì)胞穩(wěn)定易損斑塊的潛在機制。GO生物學(xué)過程和信號通路富集分析結(jié)果提示清心解瘀方可能主要參與調(diào)控巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝、遷移與吞噬、凋亡、自噬、鐵死亡等過程，從而發(fā)揮穩(wěn)定易損斑塊的作用。

脂質(zhì)代謝紊亂和脂質(zhì)沉積是AS斑塊發(fā)生和發(fā)展為易損斑塊的重要因素。升高的血清膽固醇(TC)水平可影響血管內(nèi)皮的通透性，以低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)為主的脂質(zhì)得以逐漸沉積于動脈內(nèi)膜，伴隨而來的巨噬細(xì)胞遷移和吞噬則標(biāo)志著AS斑塊正式形成的開始[12]。吞噬了大量脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞變?yōu)榕菽?xì)胞，成為斑塊壞死核心的重要組成部分，因此抗巨噬細(xì)胞泡沫化是早期抗AS的重要手段。丹參中的丹參酮ⅡA和水溶性丹參多酚酸鹽均可通過下調(diào)巨噬細(xì)胞中CD36的表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化，減少核心部分的脂質(zhì)沉積；丹參素、黃芪中的槲皮素和川芎中的川芎嗪均可作用于過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ABCA1)等參與脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因，增加膽固醇轉(zhuǎn)運、減少脂質(zhì)積累；黃連中的黃連素可作用于AMPK-SIRT1-PPARγ通路和凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1(LOX1)，減少巨噬細(xì)胞對氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的攝取，發(fā)揮抗巨噬細(xì)胞泡沫化的作用[13-14]。

AS晚期，巨噬細(xì)胞不斷凋亡的過程可產(chǎn)生持續(xù)的炎癥反應(yīng)，使得壞死核心逐漸擴大，促進了易損斑塊的形成[12]。前期研究證實，清心解瘀方可通過調(diào)控NLRP3炎癥小體活化，抑制巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥級聯(lián)反應(yīng)[7]。本研究通過基因富集分析，發(fā)現(xiàn)清心解瘀方中的丹參新醌B、異隱丹參酮、2-辛烯酸、雌三醇、刀豆氨酸等成分參與調(diào)控了巨噬細(xì)胞凋亡的生物學(xué)過程。此外，丹參新醌B、異隱丹參酮、丹參酚醌Ⅰ、二氫卡拉酮等和刀豆氨酸、2-辛烯酸等成分還分別參與了PI3K-Akt和鐵死亡信號通路。PI3K-Akt與其下游的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬的重要通路[15]，自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，在巨噬細(xì)胞中具有調(diào)節(jié)極化功能的作用，可使促炎的M1型巨噬細(xì)胞向抑炎的M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，適度激活可起到穩(wěn)定斑塊的作用[3，16]。

鐵死亡是一種鐵離子依賴性的、以細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物堆積為特征的新型細(xì)胞程序性死亡方式[17]。研究顯示，鐵過載可促進氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化等病理過程，從而影響斑塊的穩(wěn)定性。AS斑塊中活性鐵主要來源于斑塊內(nèi)的微血管破裂后出血、紅細(xì)胞進入斑塊被巨噬細(xì)胞快速溶解與吞噬的過程。巨噬細(xì)胞內(nèi)的鐵沉積增多，促進泡沫細(xì)胞的形成，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定性增高[18]。盡管目前尚無系統(tǒng)探索巨噬細(xì)胞鐵死亡與AS相關(guān)機制的研究，但已有研究顯示鐵死亡與免疫反應(yīng)和炎癥密切相關(guān)[19]，脂質(zhì)氧化、鐵沉積和斑塊內(nèi)出血等易損斑塊的標(biāo)志性病理改變進一步提示了巨噬細(xì)胞鐵死亡可能在AS和易損斑塊的形成中起到了重要作用[20]。近年來針對鐵死亡的研究逐漸增多，有學(xué)者提出靶向抑制鐵死亡有望成為防治心臟疾病的有效措施[21]。因此，清心解瘀方是否可通過抑制巨噬細(xì)胞鐵死亡穩(wěn)定易損斑塊，值得進一步深入研究。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對清心解瘀方調(diào)控巨噬細(xì)胞穩(wěn)定易損斑塊的活性成分、作用靶點和信號通路進行了探索性研究，初步發(fā)現(xiàn)其主要通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝、遷移與吞噬、凋亡、自噬與鐵死亡等途徑發(fā)揮穩(wěn)定易損斑塊的作用，為進一步深入開展清心解瘀方穩(wěn)定易損斑塊的機制研究提供了新的思路和線索。