知葛通脈顆粒對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠斑塊組織炎性因子蛋白表達(dá)水平和胸主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度的影響

謝 心，樊月月，吳 堅(jiān)

隨著生活水平的提高，我國(guó)糖尿病病人數(shù)量呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，最新研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)的糖尿病病人總數(shù)已超過(guò)1.1億人，18歲及以上人群糖尿病患病率為11.2%[1]。因此，糖尿病及其并發(fā)癥成為慢性病防治的重點(diǎn)。美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(AHA)在1999年發(fā)表的宣言中承認(rèn)糖尿病是一種心血管疾病，近年來(lái)大量流行病學(xué)資料、臨床試驗(yàn)及基礎(chǔ)研究均證實(shí)2型糖尿病是一種慢性低度炎性疾病[2-4]。循證醫(yī)學(xué)證明，嚴(yán)格控制血糖可以明顯降低糖尿病病人微血管病變發(fā)生率，但并沒(méi)有顯著降低大血管病變發(fā)生率，糖尿病病人大血管病變以發(fā)展迅速、多部位、嚴(yán)重的動(dòng)脈粥樣硬化(AS)為特點(diǎn)，是糖尿病病人致死的主要原因。AS是多種因素相互作用發(fā)生的一種慢性炎性血管病變，是一種以脂質(zhì)蓄積和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征的動(dòng)脈血管壁慢性炎癥反應(yīng)，通常有大量免疫細(xì)胞參與，為眾多心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)[5-10]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)是AS的免疫炎性因子[11-15]。胸主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度是反映AS的窗口，有利于早期病變的發(fā)現(xiàn)[16]。本研究觀察知葛通脈顆粒對(duì)糖尿病AS大鼠NF-κB、TNF-α、MMP-9、VCAM-1、MCP-1、ICAM-1、TIMP蛋白表達(dá)水平及胸主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度的變化，進(jìn)一步分析知葛通脈顆粒對(duì)糖尿病AS大鼠的療效及作用機(jī)制，為中醫(yī)藥延緩糖尿病AS進(jìn)展提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)Wistar雄性大鼠46只，由上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。飼養(yǎng)條件：室溫22～24 ℃，相對(duì)濕度40%～60%。每5只一籠，自由飲水，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料，每天07：00～19：00予以光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理號(hào)：20200125002。

1.2 藥物與試劑 知葛通脈顆粒由黃芪、葛根、炒白術(shù)、知母、山藥、天花粉、玉米須、五味子、僵蠶等組成，每袋10 g，每盒14袋，由上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院委托上海練塘藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：滬藥制字Z05050573，藥品批號(hào)分另別為20190201。瑞舒伐他汀鈉片，每片10 mg，由浙江京新藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：B2012181。鏈脲佐菌素(STZ)(美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)：WXBC6558V)。TNF-α、MMP-9、VCAM-1、ICAM-1、TIMP抗體均由上海碧云天生物技術(shù)公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為AA1129B1253CJ032、CN89320、3539BP342、GC308542、AA201901256、2256640301。HRP-羊抗兔IgG(上海碧云天生物技術(shù)公司生產(chǎn)，批號(hào)： BYT15D07AF85)。masson染液套裝(Servicebio公司生產(chǎn)，型號(hào)：G1006)、分化液(Servicebio公司生產(chǎn)，型號(hào)：G1005-3)、返藍(lán)液(Servicebio公司生產(chǎn)，型號(hào)：G1005-4)，無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：100092683)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：JJ-12J)，包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：JB-P5)，病理切片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：RM2016)，熒光生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司生產(chǎn)，BX51型)，多功能酶標(biāo)儀(美國(guó) Molecular Devices公司生產(chǎn)，型號(hào)：M5)，超細(xì)電動(dòng)勻漿器(德國(guó)Fluko公司生產(chǎn)，F(xiàn)6/10-6G型)，Western電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)，型號(hào)：1658033)。

1.4 造模方法 4周齡SPF級(jí)Wistar雄性大鼠46只，隨機(jī)選出10只為對(duì)照組，只給予基礎(chǔ)飼料，其余36只為糖尿病造模組。造模大鼠給予高糖高脂飲食，1個(gè)月誘導(dǎo)胰島素抵抗后，給予亞致病劑量(30 mg/kg)鏈脲佐菌素注射，以0.1 mol/L，pH 4.2的無(wú)菌枸櫞酸鈉緩沖液稀釋?zhuān)?0 mg/kg單次尾靜脈注射，誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生。注射1周后，尾靜脈采血，分離血清測(cè)定血糖，以血糖>16.7 mmol/L作為糖尿病大鼠造模成功，不成功者予以剔除。主動(dòng)脈內(nèi)膜球囊拉傷術(shù)結(jié)合高脂飼料喂養(yǎng)法：大鼠仰臥固定，局部剔毛消毒，應(yīng)用0.5%戊巴比妥鈉30 mg/kg經(jīng)腹腔靜脈注射麻醉后，沿頸部前正中線(xiàn)，切開(kāi)皮膚，游離出左頸外動(dòng)脈3～4 cm，將頸外動(dòng)脈先結(jié)扎遠(yuǎn)端，近端用線(xiàn)挑起以阻斷血流，在兩線(xiàn)之間的血管上壁剪一小切口，逆行插入2.5～3.0 F標(biāo)準(zhǔn)球囊導(dǎo)管至胸主動(dòng)脈，深度約5 cm，向球囊內(nèi)注入生理鹽水0.1 mL，應(yīng)用手推式壓力注射器維持壓力為4個(gè)大氣壓，然后回拉導(dǎo)管至主動(dòng)脈弓處，再回抽至囊內(nèi)壓為零，反復(fù)抽拉導(dǎo)管3次，拉傷胸主動(dòng)脈內(nèi)皮，最后退出導(dǎo)管，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，逐層縫合。術(shù)前靜脈注射肝素0.1 U/kg予以抗凝，8×105U肌內(nèi)注射3 d，以預(yù)防感染。術(shù)后造模組予高脂飼料喂養(yǎng)，配方：4%膽固醇+10%蛋黃粉+4%白糖+5%豬油+87%基礎(chǔ)飼料，加工成顆粒狀。

1.5 分組與干預(yù) 造模成功后，各組在原有飼料喂養(yǎng)下，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按血糖水平隨機(jī)分為模型組、知葛通脈顆粒組(中藥組)及瑞舒伐他汀鈉組(西藥組)，每組12只，高脂喂養(yǎng)8周后各組隨機(jī)取2只處死，解剖頸動(dòng)脈、胸主動(dòng)脈以確定造模是否成功。手術(shù)后對(duì)照組予模型組同等劑量的生理鹽水灌胃，灌胃量均為每100 g大鼠體質(zhì)量2 mL，每日1次。參考相關(guān)文獻(xiàn)計(jì)算大鼠等效劑量后，中藥組給予知葛通脈顆粒2.1 g/kg，西藥組給予瑞舒伐他汀鈉每天1.05 mg/kg[17]。繼續(xù)喂養(yǎng)6周，所有動(dòng)物自由飲水。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 蛋白表達(dá)的測(cè)定 蛋白免疫印跡法(Western Blot)定量檢測(cè)斑塊中NF-κB、TNF-α、MMP-9、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、TIMP蛋白表達(dá)的變化。處死大鼠后分離胸主動(dòng)脈斑塊組織，使用T-PER 組織蛋白提取試劑提取蛋白。用Bradford法測(cè)定蛋白含量，用SDS-PAGE法分離30 μg蛋白，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。膜在5%脫脂牛奶、含Tween-20 1%(TBST)(pH=7.5)的鹽水中孵育30 min，室溫下封閉，然后與抗體TNF-α、MMP-9、VCAM-1、ICAM-1、TIMP 和β-actin在4 ℃孵化過(guò)夜。膜用TBST洗滌3次，與HRP標(biāo)記兔二抗室溫孵育3 h。GeneGnome成像系統(tǒng)曝光，Image J軟件分析，所得灰度值即為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6.2 胸主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度及Masson染色檢查 應(yīng)用過(guò)量的戊巴比妥鈉處死所有實(shí)驗(yàn)大鼠，開(kāi)胸截取胸主動(dòng)脈至腹主動(dòng)脈全長(zhǎng)，生理鹽水沖洗干凈后，觀察斑塊形成情況，然后剪取斑塊形成處組織，分別作病理學(xué)Masson染色檢查。①石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、無(wú)水乙醇Ⅰ5 min、無(wú)水乙醇Ⅱ5 min、75%乙醇5 min，自來(lái)水沖洗。②重鉻酸鉀染色：切片入重鉻酸鉀浸泡過(guò)夜，自來(lái)水洗。③鐵蘇木素染色：鐵蘇木素A液與B液等比混合成鐵蘇木素染液，切片入鐵蘇木素3 min，自來(lái)水洗，分化液分化，自來(lái)水洗，返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗。④麗春紅酸性品紅染色：切片入麗春紅酸性品紅浸染5～10 min，自來(lái)水漂洗。⑤磷鉬酸染色：磷鉬酸水溶液浸1～3 min。⑥苯胺藍(lán)染色：磷鉬酸之后不用水洗，直接入苯胺藍(lán)染液染3～6 min。⑦分化：切片用1%冰醋酸分化，兩缸無(wú)水乙醇脫水。⑧透明封片：切片放入第三缸無(wú)水乙醇5 min，二甲苯5 min透明，中性樹(shù)膠封片。⑨顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組一般情況比較 實(shí)驗(yàn)期間，各組動(dòng)物反應(yīng)靈敏，皮毛色白、致密有光澤，進(jìn)食活躍，活動(dòng)良好，體重增長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)照組、模型組、中藥組及西藥組大鼠均無(wú)死亡，各組動(dòng)物體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組、中藥組、西藥組與模型組比較，NF-κB蛋白、TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥組與西藥組比較，NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較(±s)

2.3 各組MMP-9、VCAM-1蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組、中藥組、西藥組與模型組比較，MMP-9、VCAM-1蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥組與西藥組比較，MMP-9、VCAM-1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠MMP-9、VCAM-1蛋白表達(dá)水平比較(±s)

2.4 各組MCP-1、ICAM-1、TIMP蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組、中藥組、西藥組與模型組比較，MCP-1、ICAM-1蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與西藥組比較，中藥組MCP-1、ICAM-1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組、中藥組、西藥組與模型組比較，TIMP蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥組與西藥組比較，西藥組TIMP蛋白表達(dá)下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠MCP-1、ICAM-1、TIMP蛋白表達(dá)水平比較(±s)

2.5 各組胸主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度比較 對(duì)照組、中藥組、西藥組與模型組比較，胸主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度明顯縮小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥組胸主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度與西藥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度比較(±s) 單位：μm

2.6 胸主動(dòng)脈各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化比較 模型組脂質(zhì)沉積、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生明顯，內(nèi)見(jiàn)大量泡沫細(xì)胞、膽固醇結(jié)晶；中藥組、西藥組與模型組比較，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生減輕明顯。詳見(jiàn)圖1。

3 討 論

糖尿病AS屬中醫(yī)學(xué)“消渴病”“脈痹”范疇， 發(fā)病多見(jiàn)于中老年人，《素問(wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》云：“年四十而陰氣自半也”“年六十陰萎，氣大衰，九竅不利，下虛上實(shí)”。 基本病機(jī)為“本虛標(biāo)實(shí)”，氣陰兩虛為本，痰濁、瘀血為標(biāo)，糖尿病AS病人多年過(guò)半百，臟器虛損，機(jī)能紊亂，臟腑陰陽(yáng)氣血虧虛，而諸虛中又以氣陰兩虛為主，治療上主張益氣養(yǎng)陰為先。知葛通脈顆粒為上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院院內(nèi)制劑，已在臨床運(yùn)用20余年，由全國(guó)名老中醫(yī)、上海市名中醫(yī)奚九一教授的經(jīng)驗(yàn)方創(chuàng)制而成，由黃芪、葛根、炒白術(shù)、知母、山藥、天花粉、玉米須、五味子、僵蠶等藥物組成，具有益氣養(yǎng)陰、健脾補(bǔ)腎之功效，在防治糖尿病AS方面具有很好的臨床療效，其益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)益肝腎的治療原則符合“消渴病”氣陰兩虛的基本病機(jī)，有助于減少急性心腦血管不良事件的發(fā)生[18-19]。本研究表明：對(duì)照組、中藥組、西藥組與模型組相比較，NF-κB、TNF-α、MMP-9、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、TIMP蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)；中藥組與西藥組比較，NF-κB、TNF-α、MMP-9、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1蛋白表達(dá)水平降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；西藥組TIMP蛋白表達(dá)水平比中藥組下降更明顯(P<0.05)；對(duì)照組、中藥組、西藥組與模型組比較，胸主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度明顯減少(P<0.05)；中藥組胸主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度與西藥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明中藥組在細(xì)胞結(jié)構(gòu)的修復(fù)方面與模型組有顯著差異，更接近于西藥組，有助于糖尿病AS大鼠主動(dòng)脈各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組織修復(fù)。

綜上所述，知葛通脈顆粒可以明顯改善糖尿病AS大鼠斑塊組織NF-κB、TNF-α、MMP-9、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、TIMP的蛋白表達(dá)水平，改善胸主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度，調(diào)整內(nèi)皮功能，在防治糖尿病AS方面具有很好的臨床療效，其“益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)益肝腎”的治則符合“消渴病”氣陰兩虛的基本病機(jī)，有助于減少急性心腦血管不良事件的發(fā)生。