熄風(fēng)化痰方對(duì)急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死面積、氧化應(yīng)激的影響

馬 羚，劉 婷，房江山，尹佳琦，王 東，杜 帥，馬 娜，李 丹，張 燕，沙地克·沙吾提，

急性腦缺血是指腦組織動(dòng)脈局部供血突然減少或完全中斷，導(dǎo)致局部組織出現(xiàn)損傷、細(xì)胞及神經(jīng)元的損傷甚至凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)運(yùn)動(dòng)區(qū)域的功能障礙，嚴(yán)重影響病人的生命質(zhì)量[1]。缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，涉及氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、興奮性氨基酸、炎癥反應(yīng)和能量代謝障礙等多方面[2]。腦卒中是臨床常見、多發(fā)性疾病，具有較高的發(fā)病率、致殘率和病死率。據(jù)報(bào)道，我國每年有150萬～200萬例新發(fā)腦卒中病人，其致殘率高達(dá)80%， 一旦發(fā)病會(huì)給病人及家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)[3]。迄今為止沒有特效治療藥物和預(yù)防藥物。溶栓治療恢復(fù)血液流通是腦缺血疾病的治療方法，但是腦缺血再灌注損傷也是這個(gè)時(shí)期最為常見的腦功能異常的誘導(dǎo)因素。熄風(fēng)化痰方源于《醫(yī)學(xué)心悟》，是治療風(fēng)痰阻絡(luò)型中風(fēng)的代表方，具有息風(fēng)化痰、活血通絡(luò)之功效，正符合風(fēng)痰阻絡(luò)型中風(fēng)的病機(jī)特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)觀察熄風(fēng)化痰方對(duì)急性腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦梗死面積、氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級(jí)雄性Wistar大鼠38只，高脂飲食8周，體質(zhì)量240～280 g。由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，室溫(22±3)℃，相對(duì)濕度60%～80%，光照周期12 h/12 h，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)線栓(廣州佳靈生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，L3400)，腦組織切片模具與刀片(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad生產(chǎn)，xMarkTM)，四氮唑紅(TTC)染液(南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，D025-1-3)，蘇木素染液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)，CTS-1097)，伊紅染液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，ZLI-9613)，中性樹膠(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，ZLI-9555)，丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，A003-1)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，A001-3)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，A005)，總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，A0145)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 將38只大鼠隨機(jī)分為3組。模型組：15只(取材8只)，每日灌服3.6 mL生理鹽水，連續(xù)灌服2周，采用大腦MCAO線栓法阻斷大腦中動(dòng)脈，構(gòu)建大鼠MCAO缺血再灌注模型，缺血2 h再灌注24 h，術(shù)后直接采血，斷頭取腦。中藥組：15只(取材8只)，按9.21 g/kg每日灌服1次熄風(fēng)化痰方3.6 mL，連續(xù)灌服2周，最后一次灌服為術(shù)前1 h，手術(shù)方式同模型組。假手術(shù)組：8只，每日灌服等體積生理鹽水，連續(xù)灌服2周，手術(shù)方式同模型組，但不做栓塞，僅暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，然后逐層縫合，術(shù)后24 h采血，斷頭取腦。

1.3.2 建立動(dòng)物模型 ①大鼠用2%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部用碘伏消毒后正中偏右0.5 cm處縱向切開2 cm的切口。②分離右側(cè)CCA、ECA、ICA，其中ECA需暴露3～5 mm，ICA需分離至翼腭動(dòng)脈，在ECA遠(yuǎn)端距CCA 分叉處3～5 mm處結(jié)扎ECA。③用縫合線在上述結(jié)扎點(diǎn)遠(yuǎn)心端結(jié)扎ECA，用眼科手術(shù)剪在兩個(gè)結(jié)扎點(diǎn)之間剪斷ECA。④將ECA向鼠尾方向牽拉，使ECA和ICA成一條直線。⑤動(dòng)脈夾夾閉CCA近心端及ICA遠(yuǎn)心端，在ECA結(jié)扎點(diǎn)前端剪一“V”形小口，緩慢將栓塞線經(jīng)ECA插入ICA，打開ICA遠(yuǎn)心端動(dòng)脈夾。⑥根據(jù)栓塞線上的標(biāo)記，判斷栓塞線插入深度。當(dāng)CCA 分叉進(jìn)入栓塞線1.8～2.2 cm標(biāo)記之間區(qū)域時(shí)，插線力度一定要輕，稍感阻力立即停止向前插線。⑦在“V”形切口近心端結(jié)扎ECA，使栓塞線和ECA 固定在一起。⑧剪斷各結(jié)扎點(diǎn)上的手術(shù)線，逐層縫合，將栓塞線多余的部分縫合在創(chuàng)口之間，暴露于皮外。缺血2 h再灌注的具體方法是將縫合線打開，完全暴露栓塞線，用眼科鑷子固定結(jié)扎點(diǎn)，將栓塞線慢慢抽出，直至栓塞線上的0.6 cm處標(biāo)記點(diǎn)暴露出來為止，剪掉栓塞線多余部分，逐層縫合創(chuàng)口。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 抽取腹主動(dòng)脈血，4 ℃，3 000 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃保存，分別檢測MDA、SOD、GSH-Px、T-AOC指標(biāo)，檢測方法按照檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.2 腦梗死面積檢測 大鼠斷頭取完整腦組織，每組6只大鼠腦組織用于TTC染色[4 ℃的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)浸泡后轉(zhuǎn)移至-20 ℃凍存]，剩余2只大鼠腦組織用于蘇木素-伊紅(HE)染色(直接固定于4%多聚甲醛)。①TTC染色。取假手術(shù)組、模型組和中藥組大鼠腦組織，用2%的TTC染料常規(guī)染色，根據(jù)病理圖像分析腦梗死面積，具體操作如下：斷頭法處死大鼠后迅速取腦組織(10 min內(nèi))置于4 ℃的PBS溶液中浸泡后轉(zhuǎn)移至-20 ℃冰箱冷凍30 min；切取冠狀位腦片，厚度為2 mm，將腦片放入2%的TTC染料中37 ℃避光水浴30 min，每5 min輕微晃動(dòng)容器，使充分染色；取出腦片用PBS溶液洗滌3～5 min進(jìn)行拍照；選擇每一切片的尾側(cè)面用病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測量每片的梗死面積和總面積。②HE染色：腦組織使用4%多聚甲醛固定36～48 h，石蠟包埋，切片厚度5 m，經(jīng)脫蠟、脫二甲苯、水洗、HE染色等步驟，最后用中性樹膠封片，鏡下觀察腦組織的病理變化情況。

2 結(jié) 果

2.1 3組氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組和中藥組MDA水平升高，SOD、GSH-Px、T-AOC水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，中藥組MDA水平降低，SOD、GSH-Px水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組氧化應(yīng)激指標(biāo)比較(±s)

2.2 3組腦梗死面積比較 與假手術(shù)組比較，模型組和中藥組腦梗死面積增加，與模型組比較，中藥組腦梗死面積減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2、圖1。

圖1 3組腦梗死面積柱狀圖

表2 3組腦梗面積比較(±s) 單位：mm2

2.3 3組腦組織的病理變化情況比較 鏡下觀察：假手術(shù)組神經(jīng)元分布尚均勻，層次清晰，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較正常，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚清晰。模型組神經(jīng)元分布尚均勻，層次欠清晰，部分核染色深、濃縮，未見核仁；部分核邊界模糊；大部分神經(jīng)元胞界不清，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠清晰。與模型組比較，中藥組神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞病理改變明顯減輕。詳見圖2。

圖2 3組腦組織HE染色結(jié)果

3 討 論

急性腦缺血屬于中醫(yī)缺血性中風(fēng)病，從古至今，中風(fēng)一直是人類的重大疾病，《內(nèi)經(jīng)》無“中風(fēng)”之名，但對(duì)《內(nèi)經(jīng)》所載與中風(fēng)臨床表現(xiàn)相似病癥及其病機(jī)的分析闡發(fā)，《內(nèi)經(jīng)》所述大厥、煎厥、薄厥、仆擊、痱、風(fēng)痱、偏枯、偏風(fēng)、偏身不遂、偏身不用等病癥，從發(fā)病形式、臨床特征、病因病機(jī)等方面皆與中風(fēng)類似[4]。國內(nèi)中醫(yī)急癥腦病組認(rèn)為中風(fēng)是多種原因的“腦脈痹阻或血溢腦脈之外”所致，明確中風(fēng)的病位在腦，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所說腦梗死或腦出血相似[5-7]。痰濁與瘀血是中風(fēng)發(fā)病的主要病理產(chǎn)物及致病因素，并貫穿疾病發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過程。《本草新編》指出：“中風(fēng)未有不成痰血者也”[8]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為天人合一，人生活在自然界中，當(dāng)人感受風(fēng)邪后，以風(fēng)邪、痰濕尤甚，復(fù)因飲食、情志、勞倦等所傷，導(dǎo)致體內(nèi)風(fēng)痰瘀阻、脈絡(luò)不通，最終臟腑失調(diào)，氣血逆亂而發(fā)為中風(fēng)。腦血管堵塞后，使得大腦特定區(qū)域得不到血液的灌注和氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)的支持，導(dǎo)致區(qū)域性的腦損傷和腦半球梗死，最終嚴(yán)重致殘或死亡[9]。由于老年人氣血瘀滯、脈絡(luò)不暢、五臟功能衰退，因此，該病在老年人中發(fā)病率較高。風(fēng)痰阻絡(luò)證屬于缺血性中風(fēng)病急性期的主要證型之一，治療關(guān)鍵在于息風(fēng)化痰、活血通絡(luò)，而熄風(fēng)化痰方有息風(fēng)化痰之功，主治中風(fēng)病和中風(fēng)后遺癥等。

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組和中藥組腦梗死面積增加，血MDA水平升高，血SOD、GSH-Px、T-AOC水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，中藥組腦梗死面積減少，血MDA水平降低，SOD、GSH-Px水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。可見熄風(fēng)化痰方治療腦缺血療效較好。熄風(fēng)化痰方中姜半夏燥濕化痰、降逆止嘔，天麻平肝息風(fēng)、止頭眩，兩者合用，為治療風(fēng)痰阻絡(luò)中風(fēng)之要藥，李東垣《脾胃論》：“足太陰痰厥頭痛，非半夏不能療；眼黑頭眩，風(fēng)虛內(nèi)做，非天麻不能除”，故以兩味藥為君藥。茯苓、白術(shù)健脾祛濕，以絕生痰之源；砂仁化濕行氣；川芎、丹參活血化瘀、行氣化滯；石菖蒲醒腦開竅、和胃化濕；陳皮理氣化痰；白芷、荷葉、谷精草升陽開竅、清利頭目；使以甘草和中調(diào)藥[10]。縱觀全方，風(fēng)痰并治，標(biāo)本兼顧，但以化痰息風(fēng)治標(biāo)為主，健脾祛濕治本為輔。Liu等[11]研究發(fā)現(xiàn)天麻素能夠緩解亞急性期大腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)以及凋亡有關(guān)。此外，天麻素能夠治療脊髓損傷，其機(jī)制可能也與其抗氧化及抗炎特性有關(guān)：神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、活性氧自由基(ROS)、MDA等抗炎因子明顯提升，脊髓神經(jīng)細(xì)胞線粒體SOD、GSH-Px、T-AOC明顯下降[12-13]。李文君等[14]研究表明，天麻素能夠降低血腦屏障的通透性，抑制局部炎癥反應(yīng)，從而改善MACO大鼠神經(jīng)功能缺失。何珊珊等[15]研究發(fā)現(xiàn)，天麻素能夠上調(diào)MCAO小鼠Doublecortin(DCX)的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元，進(jìn)而減輕腦缺血再灌注損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，在大鼠缺血灌注后24 h，熄風(fēng)化痰方能夠降低血清中MDA水平、提高SOD、GSH-Px水平。提示熄風(fēng)化痰方有顯著的抗炎作用。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，中藥天麻的主要成分天麻素能夠改善椎基底動(dòng)脈供血不足，有效治療前庭系統(tǒng)疾病，同時(shí)還能擴(kuò)張血管，有效預(yù)防血栓形成，改善微循環(huán)，保護(hù)腦細(xì)胞，減輕缺血再灌注損傷，抑制凋亡等[16-20]。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，熄風(fēng)化痰活血飲通過上調(diào)缺血再灌注后腦組織神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，起到腦保護(hù)作用[21]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用TTC染色法檢測腦梗死面積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比較，在大鼠腦缺血再灌注后24 h，熄風(fēng)化痰方能夠減少大鼠腦組織梗死面積，也提示了熄風(fēng)化痰方具有明顯抑制凋亡的作用。

綜上所述，熄風(fēng)化痰方能夠通過調(diào)節(jié)血MDA、SOD、GSH-Px、T-AOC水平，緩解神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞的病變，減少腦梗死面積，為臨床治療缺血性腦血管病提供了更好的用藥途徑。