丹梔逍遙散對廣泛性焦慮大鼠Papez環路內神經營養因子及受體表達的影響

李 藝，唐啟盛，王 戈，趙瑞珍

廣泛性焦慮障礙(generalized anxiety disorder，GAD)是以缺乏明確對象和具體內容的持續而明顯的緊張不安，并以伴有自主神經功能興奮和過分警覺為特征的慢性焦慮障礙，為焦慮障礙最常見的亞型之一[1]。隨著現代社會的快速發展，工作、生活壓力越來越大，GAD的發病率呈逐年上升趨勢[2]。神經營養因子(neurotrophic factors，NTFs)主要由神經元、神經支配的靶組織和膠質細胞合成并分泌，能有效營養和保護中樞和外周神經，促進神經元的分化、生長和存活，神經營養因子及其相關的受體在神經系統正常生理功能的維持和病理狀態下的修復與再生中扮演著重要角色。Papez環路是多種精神情感障礙的病理學結構基礎。腦內神經營養因子在GAD發病與修復中的作用目前尚未闡明，通過病理學、細胞學和分子生物學等實驗手段研究發現，GAD大鼠Papez環路區域內(包括海馬、乳頭體、杏仁核復合體、丘腦前核等部位)存在著廣泛的細胞損傷、凋亡與壞死，而機體自身進行的神經修復與再生需要包含多種神經營養因子及其受體在內的局部微環境的營養與調控[3-4]。因此，本實驗從神經修復的角度出發，采用天敵暴露飲水沖突刺激法建立GAD大鼠模型，通過免疫組織化學方法檢測GAD大鼠腦Papez環路區域內海馬(包括CA1、CA2、CA3、DG區)、杏仁核和丘腦前核等部位神經營養因子[腦源性神經營養因子(BDNF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、神經生長因子(NGF)]及腦源性神經營養因子受體(TrkB)、堿性成纖維生長因子受體(bFGFR)的表達水平以及丹梔逍遙散的干預效用，以期進一步揭示神經營養因子及其受體在GAD發病與修復中的作用以及疏肝清熱健脾法對GAD中樞神經修復的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠，體質量(200±10)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。大鼠購入后，適應性飼養1周，自由攝食飲水。明暗光照各12 h，室溫(20±2)℃，相對濕度50%～60%，保持安靜。

1.1.2 實驗藥物 中藥丹梔逍遙散(柴胡15 g、梔子10 g、牡丹皮10 g、炒白術15 g等)由北京中醫藥大學第三附屬醫院提供，按灌胃劑量煎藥濃縮，濃度為1.05 g/mL，貯存于4 ℃冰箱中備用，臨用前加熱。鹽酸丁螺環酮片(西南合成藥業股份有限公司生產，國藥準字H19990302)按照成人用量的7倍計算大鼠用量為每天2 mg/kg，臨用時溶于蒸餾水中混勻，濃度為0.20 g/L。

1.1.3 實驗試劑 兔抗大鼠BDNF一抗兔抗大鼠TrkB一抗、兔抗大鼠bFGF一抗、兔抗大鼠bFGFR一抗、兔抗大鼠NGF一抗，均購于武漢博士德公司；SP法超敏二抗試劑盒，購于福州邁新生物技術公司；DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物技術公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、枸櫞酸、多聚賴氨酸、蛋白酶K均購于福州邁新生物技術公司；多聚甲醛、二甲苯、石蠟、水合氯醛均購于北京化工廠；中性樹膠購于北京中杉金橋生物公司。

1.1.4 實驗儀器 十字迷宮(北京中醫藥大學基礎醫學院提供)；DHG-9023A電熱恒溫鼓風干燥機(廣州漢迪環境試驗設備公司)；6D生物組織包埋機(金華市益迪醫療設備公司)；PN006072石蠟切片機(北京亞興泰機電設備公司)；Olympus BX53正置顯微鏡(日本Olympus株式會社)；Olympus DP72照相系統(日本Olympus株式會社)；Olympus Cellsense成像軟件(日本Olympus株式會社)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與給藥 大鼠適應性飼養1周后進行OPEN-FIELD行為學評分，取評分相近的大鼠32只，按照隨機數字表分為正常組、模型組、中藥組和西藥組，每組8只。自造模第1天起，正常組和模型組予蒸餾水灌胃，西藥組予鹽酸丁螺環酮溶液1 mL/100 g灌胃，中藥組予丹梔逍遙散濃縮藥汁1 mL/100 g灌胃，每天1次，連續21 d。

1.2.2 模型制備 大鼠適應性飼養及分組結束后，模型組、西藥組、中藥組與灌胃同步進行天敵暴露飲水沖突模型制備。模型制備分兩種方式進行應激，兩種應激每天使用1種，交替使用21 d。①飲水沖突應激：大鼠先剝奪飲水24 h后再允許飲水，每當舔吸水管口達20次就給予1.2 mA電流令其遭受電擊，電流來自于鼠籠底部有導電功能且與電擊控制設備相連接的金屬柵欄，每次應激持續時間3 min。應激時由3名觀察者觀察并記錄大鼠應激期間飲水次數，以3位觀察者觀察結果的平均數作為飲水沖突應激時飲水次數的值。②天敵暴露應激：本實驗以貓作為對大鼠造成威脅的天敵，實驗用貓每日僅進食30 g小鼠1只，確保在實驗中處于饑餓狀態，維持其對大鼠天然的攻擊性。在大鼠進行飲水沖突的次日進行天敵暴露應激，應激時將大鼠以每籠1只置于貓籠內，將貓引入貓籠，貓可在籠內自由活動，大鼠暴露于貓每次45 min。模型制備期間，3組大鼠應激操作均于每日08：00～11：30進行，應激前3組大鼠提前30 min進入實驗室適應環境，操作時抓取動物保持輕柔。

1.2.3 行為學測試 分別在造模開始后的第7天、第14天、第21天對4組大鼠進行高架十字迷宮(EPM)行為學測試[5-6]。實驗開始時將大鼠從中央區面向閉合臂放入迷宮，記錄5 min內大鼠的活動情況。觀察大鼠閉合臂進入次數(CE，必須有兩只前爪進入壁內)、開放臂進入次數(OE)、閉合臂停留時間(CT)、開放臂停留時間(OT)。計算OE占兩臂總次數(TE)的百分比、OT占兩臂總時間(TT)的百分比。

1.2.4 取材及處理 最后一次行為學測試結束后進行取材，將大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，劑量為0.4 mL/100 g。將大鼠固定在解剖板上，斷頭取腦后，投入4%多聚甲醛中固定。24 h后，取出腦組織，經預處理后，在自動石蠟包埋機上對大鼠的腦標本進行石蠟包埋，待冷卻堅硬后，在輪轉切片機上對腦的丘腦前核層面、海馬杏仁核層面進行切片，切片厚度為6 μm。在撈片機中將組織切片貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，40 ℃溫箱烘烤過夜，備用。

1.2.5 免疫組織化學SP法檢測Papez環路內海馬(CA1、CA2、CA3、DG區)和杏仁核、丘腦前核的BDNF、bFGF、NGF、TrkB、bFGFR的表達 具體步驟如下：每組隨機選取丘腦前核層面、海馬杏仁核層面各8張石蠟切片，脫蠟，水合；PBS沖洗切片3遍，每次5 min，分別在每張切片滴加50 μL蛋白酶K以增加細胞通透性，37 ℃下避光孵育10 min；PBS沖洗切片3遍，每次5 min；將切片放入枸櫞酸溶液內，煮沸10 min，取出，自然冷卻至室溫；每張切片滴加50 μL 3% 過氧化氫(H2O2)，室溫避光反應10 min；PBS沖洗切片3遍，每次5 min；每張切片滴加50 μL羊血清工作液，室溫避光孵育10 min；甩干羊血清，每張切片滴加50 μL兔抗大鼠一抗，避光孵育，4 ℃過夜；PBS沖洗切片3遍，每次5 min；每張切片分別滴加羊抗兔二抗工作液50 μL，避光室溫孵育10 min；PBS沖洗切片3遍，每次5 min；每張切片分別滴加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶50 μL，避光室溫孵育10 min；PBS沖洗切片3遍，每次5 min；每張切片上滴加二氨基聯苯胺(DAB)顯色液50 μL，光鏡下觀察并控制顯色時間，約為10 min；蒸餾水洗玻片3次，每次5 min，以終止顯色反應；脫水；通風櫥內浸泡入二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min；每張切片滴加1滴中性樹膠，封片；待玻片完全干燥后，在光學顯微鏡下觀察，拍照。每張切片隨機選取1個200倍視野和4個400倍視野照相，image pro plus 6.0軟件測算陽性表達部位的積分光密度值(integral optical density，IOD)，并根據公式IOD=AOD(平均光密度值)×A(陽性表達區域的面積)計算出AOD。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況 21 d造模及藥物干預結束后，肉眼觀察4組大鼠的一般情況。天敵暴露期間的大鼠在面對天敵威脅時表現出焦慮樣行為，如四處閃躲、行動較少、反復蹲伏、瑟縮顫抖、動作僵硬、排泄糞便變多等；飲水沖突應激期間大鼠被電擊后表現出短暫的停滯僵硬、毛發聳立或逃竄、不停尖叫，電擊后再飲水時表現出膽怯、畏縮。正常組大鼠體型飽滿、皮毛濡潤、精力旺盛、活動靈活、飲食正常、體質量增加；模型組、中藥組和西藥組大鼠較正常組體型瘦薄、皮毛枯糙、神情慵懶、活動遲鈍、飲食減少、易被激惹。造模及藥物干預期間，4組大鼠均無死亡。

2.2 丹梔逍遙散對GAD大鼠行為學的影響 與正常組比較，模型組、中藥組、西藥組在第7天、第14天時，OE/TE、OT/TT值均下降，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。第21天時，與正常組比較，模型組、西藥組OE/TE、OT/TT值均下降，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，中藥組、西藥組OE/TE、OT/TT值均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠于造模開始后第7天、第14天、第21天高架十字迷宮測試結果比較(±s) 單位：%

2.3 丹梔逍遙散對大鼠腦Papez環路區域內神經營養因子及其受體表達的影響 與正常組比較，模型組海馬各區和杏仁核區TrkB、NGF的表達水平有明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；模型組海馬各區bFGF、bFGFR表達水平明顯升高，杏仁核區表達水平明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；模型組海馬各區及杏仁核區、丘腦前核區BDNF表達與其他3組間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，但海馬CA1區模型組較正常組有下降趨勢。

與模型組比較,中藥組海馬各區和杏仁核區bFGF、TrkB、NGF表達水平明顯升高,西藥組bFGF在海馬CA2區、CA3區、DG區和杏仁核區均升高,西藥組TrkB在海馬各區和杏仁核區均升高,西藥組NGF在杏仁核區升高,差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；中藥組海馬各區和杏仁核區bFGFR表達水平明顯升高,西藥組海馬各區bFGFR表達水平明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；丘腦前核區的表達在模型組與正常組以及中藥組與西藥組之間比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠腦Papez環路區域內神經營養因子及其受體表達的變化(±s)

3 討 論

Perez于2009年發現bFGF是參與調節心境的關鍵因素，但是bFGF與其受體bFGFR在 GAD 中的表達水平變化目前尚無定論。有研究發現，慢性應激可以引起皮質、海馬 CA1、CA3 區的錐體細胞及齒狀回的顆粒細胞內的bFGF含量明顯下降。同時，肖娟娟等[7]的實驗結果提示，接受慢性復合應激刺激的大鼠海馬內 bFGF 的陽性細胞數增加而且bFGF的平均表達水平上調。常憲魯等[8]發現青少年首發GAD病人血清BDNF、IL-6水平較健康對照均升高，且兩者存在相關性，可能參與了青少年首發GAD病理生理過程。BDNF已被報道具有抗焦慮作用，增強γ氨基丁酸(GABA)突觸傳遞。Iba等[9]發現治療經前期綜合征(PMS)伴焦慮的中草藥乙醇提取物(EE-IHW)通過增加杏仁核β2-亞基和BDNF，增加GABA受體介導的信號，從而減弱孕酮戒斷引起的焦慮樣行為。Dutt等[10]發現帕羅西汀對GAD病人的治療效果明顯改善，反映了心臟自主張力和BDNF水平的恢復，暗示了他們作為潛在的生物標志物的作用。此外，何正初等[11]發現越鞠丸可明顯降低創傷后應激障礙(PTSD)大鼠的恐懼記憶和自主活動、改善焦慮行為，并維持PTSD大鼠海馬組織中的BDNF、5-羥色胺1A(5-HT1A)、5-HT2A的表達。趙小林等[12]實驗證實，抑郁伴焦慮病人血漿NGF水平較正常組有明顯升高。Fernandes等[13]實驗結果提示NGF在實驗性腦缺血再灌注后14 d參與了焦慮樣行為。

本研究結果顯示，bFGF與其bFGFR在海馬、杏仁核和丘腦前核內的神經元的胞漿與軸突內均有表達，模型組大鼠海馬各區bFGF及其受體bFGFR的AOD值較正常組明顯升高，表明在以上腦區內bFGF和bFGFR的蛋白總量和陽性表達區域內的平均含量均增加，提示bFGF及其受體對神經損傷較為敏感，機體自身在神經元損傷或凋亡的早期能夠反應性的分泌更多bFGF，使得bFGF能夠相對于其他神經營養因子更為積極的代償性表達，同時其受體bFGFR適應性的表達上調，從而積極地促進神經的修復和再生。模型組大鼠bFGF和bFGFR在杏仁核內的表達水平相比正常組明顯下降，提示杏仁核內的bFGF和bFGFR可能對損傷性刺激的代償性反應不如海馬區敏感。但是，經過中藥丹梔逍遙散干預后的GAD大鼠海馬各區和杏仁核區內bFGF和其受體bFGFR的表達水平相較于模型組都明顯升高，提示疏肝清熱健脾法能夠通過刺激bFGF和bFGFR在杏仁核的表達以及在海馬內的進一步表達來發揮二者的促神經修復功能。

本研究結果顯示，BDNF和NGF主要在海馬、杏仁核和丘腦前核神經元的胞漿中表達，突起內亦有少量表達，TrkB主要存在于神經元胞膜和胞漿內。模型組大鼠海馬各區和杏仁核內BDNF蛋白的AOD值與正常組比較并無明顯差異，提示相應表達區域內BDNF的平均含量無明顯變化，但BDNF的陽性表達區域面積減小，陽性細胞數量減少；模型組大鼠的TrkB在海馬各區和杏仁核內的AOD值明顯下降，陽性表達區域內TrkB的平均含量亦減少；對NGF表達水平的測試結果顯示，模型組大鼠海馬4個分區和杏仁核內NGF蛋白的AOD值較正常組都明顯下降，表明在以上腦區內TrkB和NGF的蛋白總量和陽性表達區域內平均含量減少。提示慢性心理應激可以導致海馬、杏仁核內BDNF表達水平下降，進而導致其高親和力受體TrkB適應性表達下調，同時NGF的表達水平也有明顯降低，BDNF和NGF含量下降可能下調了多條細胞內信號轉導途徑(如MAPK/ERK通路等)的功能，進而其營養、保護神經元的作用受到抑制，機體對外界應激的適應性降低，神經的可塑性被削弱，神經易損的敏感性得到提高，或者進一步影響了5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)等相關神經遞質的合成與釋放，從而導致GAD發病以及Papez環路內細胞損傷與凋亡的出現?？梢?，BDNF和NGF表達水平的下調有可能作為始動環節之一參與了GAD的發病機制，而且與Papez環路內的細胞損傷與凋亡密切相關。

經過中藥丹梔逍遙散干預的GAD大鼠，海馬各區和杏仁核區內BDNF的受體bFGFR、TrkB和NGF的表達水平有了明顯回升，有利于BDNF、NGF更好地發揮其生理功能，促進損傷腦區局部微環境的恢復，增強神經可塑性，保護神經元，抑制凋亡與壞死，促進神經的修復以及神經干細胞(NSCs)的增殖與分化。

丘腦前核作為Papez環路中的重要組成部分之一，本研究并未發現丘腦前核中BDNF、bFGF、NGF及受體TrkB、bFGFR的表達水平的明顯變化，提示丘腦前核區可能對本實驗采用的天敵暴露飲水沖突應激方式并不敏感，或者此5種蛋白與丘腦前核區的損傷與修復并無密切聯系，而其他種類的神經營養因子和相關蛋白是否可能通過不同的途徑或機制積極地參與了GAD中丘腦前核區的損傷與修復進程，還有待于進一步深入的研究。