冠心病病人血清lncRNA-MALAT1表達水平及臨床意義

田紅彪，王玉霄，鄭曉拓，王 燕，孫麗靜

冠心病是導致人類死亡的主要疾病之一，我國冠心病的患病數達1 100萬人，且患病率及死亡率均有增加趨勢[1]。許多心血管疾病的危險因素，例如脂質堆積、高血糖和氧化應激等均能影響血管內皮細胞的功能，引起血管性疾病，例如冠狀動脈粥樣硬化，進而引起嚴重的心臟損傷或重塑。深入研究冠心病發生發展的分子機制，尋找新的診斷及治療的生物標志物具有重要意義。長鏈非編碼核糖核酸(long none coding RNA，lncRNA)是長度大于200核苷酸的非編碼RNA分子。lncRNA能通過表觀遺傳學修飾、結合微小RNA等機制對基因表達進行調控，影響細胞的發育、分化、代謝及衰老等過程[2]。lncRNA轉移相關的肺腺癌轉錄本1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)基因位于11q13.1，該基因具有兩個外顯子，成熟轉錄本3′端沒有poly A尾巴。lncRNA-MALAT1位于細胞核中，可作為核糖核蛋白復合物的分子支架[3]。此外，lncRNA-MALAT1可作為許多基因的轉錄調節因子，包括影響細胞遷移、細胞周期調控相關基因等[4-5]。lncRNA-MALAT1在心血管疾病中具有重要的作用，有研究發現，在缺氧、高血糖、細胞因子和氧化應激等條件刺激下的血管內皮細胞及心肌細胞中lncRNA-MALAT1表達上調，并且是心血管疾病的重要危險因素[6-7]。本研究觀察冠心病病人血清lncRNA-MALAT1水平變化，并初步分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年3月—2019年3月保定市第四中心醫院診治的冠心病病人119例為冠心病組，年齡34～76(57.4±6.7)歲，男76例，女43例；選取同期就診的且經冠狀動脈造影顯示排除冠心病的病人80例為對照組，年齡35～77(58.1±7.1)歲，男56例，女24例。納入標準：冠狀動脈造影結果為左主干、左前降支、回旋支、右冠狀動脈等1支以上血管狹窄程度≥50%，每支血管至少進行3個多體位測定。排除標準：伴有嚴重的肝腎功能不全、血液系統疾病、心律失常、感染性疾病及慢性阻塞性心臟病。本研究經醫院倫理委員會審核通過，所有病人均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測指標及方法

1.2.1 實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測血清中lncRNA-MALAT1表達 采取兩組研究對象清晨空腹靜脈血5 mL置于EDTA抗凝管中，小型高速低溫離心機(德國艾本德公司生產，型號5910R)4 ℃12 000 g離心10 min，取上清于-80 ℃冰箱保存。Trizol法提取總RNA：取0.25 mL血清，按Trizol與樣品體積3∶1混勻靜置5 min后加入0.5 mL氯仿，混勻并靜置10 min后于4 ℃下12 000 g離心10 min，取上層水相；加異丙醇0.5 mL，4 ℃下12 000 g離心10 min，去上清，75%乙醇洗滌；4 ℃下12 000 g離心5 min，棄上清，空氣干燥RNA，加入0.5 mL 焦碳酸二乙酯(DEPC)水，Narodrop2000微量紫外分光光度計(美國賽默飛公司生產，型號：ND2000)鑒定RNA的濃度及純度。1 μg總RNA為模板進行反轉錄：以cDNA為模板進行qRT-PCR反應(qPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，貨號：RR420A)，總反應體系20 μL，cDNA 1 μL，2×SYBR Green Premix 10 μL，正向和反向引物各1 μL，加RNA-free水至20 μL；反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，變性退火延伸共40個循環。lncRNA-MALAT1正向引物序列為5′-GCTCAAATCTTTCCACACGCT-3′，反向引物序列為5′-TCGGTTAAAAATAGGTTCTAGTT-3′；內參基因GAPDH正向引物序列為5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，反向引物序列為5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。結果采用2-ΔΔCt值法進行分析，其中ΔCt=CtlncRNA-MALAT1-CtGAPDH。

1.2.2 臨床資料 包括性別、年齡、體質指數(BMI)、高血壓史、糖尿病史及吸煙史。貝克曼庫爾特全自動生化分析儀(美國貝克曼公司生產，型號：AU5800)檢測血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。

2 結 果

2.1 兩組一般資料及血清lncRNA-MALAT1水平比較 冠心病組與對照組糖尿病史、高血壓史、高血脂、LDL-C水平及lncRNA-MALAT1相對表達量比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；性別、年齡、BMI、吸煙史，血清TG、TC、HDL-C、HbA1c水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 兩組一般資料及血清lncRNA-MALAT1水平比較

2.2 冠心病危險因素Logistic回歸分析 將糖尿病史、高血壓史、高血脂、LDL-C水平及lncRNA-MALAT1相對表達量5個因素納入回歸模型進行Logistic回歸分析，結果表明，糖尿病史、高血壓史、高血脂、LDL-C水平及lncRNA-MALAT1相對表達量是冠心病的獨立危險因素(P<0.05)。詳見表2。

表2 冠心病危險因素Logistic回歸分析

2.3 血清lncRNA-MALAT1相對表達量水平診斷冠心病的價值 應用ROC曲線分析血清lncRNA-MALAT1相對表達量對冠心病的診斷價值，結果顯示，lncRNA-MALAT1相對表達量的曲線下面積(AUC)為0.847[95%CI為(0.758，0.931)]，最佳臨界值為0.912時，診斷的靈敏度及特異度分別為81.0%、76.5%。詳見圖1。

圖1 血清lncRNA-MALAT1相對表達量診斷冠心病價值的ROC曲線分析

3 討 論

冠心病是冠狀動脈粥樣硬化導致的痙攣、狹窄或梗阻的心臟疾病，其發病率及死亡率較高，且隨著我國人民生活水平的提高，發病率有不斷上升的趨勢，嚴重威脅我國人民的健康[8]。冠心病的主要發病機制是高血壓、高血脂及糖尿病等多種因素長期氧化應激損傷血管內皮細胞，導致血管內皮細胞功能紊亂、泡沫細胞形成，血管平滑肌細胞增殖的同時向血管內皮下遷移，導致動脈粥樣硬化的發生。本研究經Logistic回歸分析結果顯示，糖尿病史、高血壓史、高血脂、LDL-C是冠心病發生的危險因素。目前，對冠心病的診斷主要依賴醫生經驗、物理診斷及實驗室檢查等，近年來隨著分子生物學的發展，發現動脈粥樣硬化是多種不同細胞相互作用的病理過程，受到多種編碼及非編碼基因的調控，因而尋找冠心病易感基因及特征性的分子標志物，可能有利于冠心病的早期診斷[9-10]。lncRNA是細胞內無蛋白編碼功能的RNA調控分子，參與細胞內基因表達調控、染色體修飾等生物學過程，與多種心臟疾病密切相關[11]。lncRNA-MALAT1是長度為8.5 kb的長非編碼RNA，最早是在非小細胞肺癌的研究中發現，后來發現其在正常組織中廣泛表達。lncRNA-MALAT1位于細胞核內，是高度保守的基因，在個體發育和進化中均具有重要功能。國外有研究發現，lncRNA-MALAT1能夠通過激活絲裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)及mTOR信號通路抑制血管內皮祖細胞(EPC)自噬、EPC細胞凋亡，促進冠狀動脈粥樣硬化的發生，參與冠心病的發生發展，可能是預測冠心病發生的分子標志物[12]。本研究中，冠心病組病人血清lncRNA-MALAT1相對表達量水平明顯高于對照組，表明冠心病病人血清lncRNA-MALAT1相對表達量水平升高，但其具體機制尚不清楚，可能與MALAT1基因轉錄后調控異常有關。研究表明，lncRNA-MALAT1基因的表達受到微小RNA(miRNA)的調控，如miR-663能結合到lncRNA-MALAT1信使RNA的3′非編碼區，負向調控lncRNA-MALAT1的表達[13]。國內研究報道，冠心病miR-663表達水平顯著降低，其抑制lncRNA-MALAT1表達的能力降低，導致lncRNA-MALAT1水平升高，最終促進動脈粥樣硬化的發生發展[14-15]。Logistic回歸分析結果表明，lncRNA-MALAT1是冠心病的獨立危險因素，因此，lncRNA-MALAT1可能是參與冠心病發生發展過程的重要因子。有研究表明，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)能夠誘導巨噬細胞中lncRNA-MALAT1轉錄，而lncRNA-MALAT1能夠將β-連環素(β-catenin)募集到CD36啟動子的結合位點上以誘導CD36表達，從而增強巨噬細胞的脂質攝取，促進動脈粥樣硬化的形成[16]。此外，ox-LDL能夠通過上調血管內皮細胞中lncRNA-MALAT1的表達，激活Wnt/β-catenin信號通路，促進內皮細胞向間質細胞轉化，參與動脈粥樣硬化的發生[17]。研究表明，lncRNA-MALAT1具有作為分子海綿結合并抑制下游miRNA的生物學功能的作用，間接調節下游脂代謝相關基因的表達，導致血管內皮細胞脂質堆積，泡沫細胞形成，加重動脈粥樣硬化[18]。本研究進一步分析血清lncRNA-MALAT1相對表達量水平對冠心病的診斷價值，結果顯示其具有較高的靈敏度及特異度，具有一定的臨床診斷價值，有可能成為冠心病診斷的特異性血清分子標志物，但血清lncRNA-MALAT1水平能否作為冠心病病人危險評估及干預治療預后評估的標志物，有待進一步深入研究。

綜上所述，冠心病病人外周血血清lncRNA-MALAT1相對表達量升高，血清lncRNA-MALAT1參與冠心病的發生發展，是冠心病的獨立危險因素。血清lncRNA-MALAT1相對表達量對冠心病具有一定的診斷價值，檢測冠心病病人血清lncRNA-MALAT1相對表達量水平可能是一種新的診斷冠心病的血清分子標志物。