基于網絡藥理學探討黃芪治療玫瑰痤瘡的主要成分及作用機制

康羲，黃鶯

(成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都 610000)

0 引言

玫瑰痤瘡是一種常見于面部的慢性反復發作性疾病，中醫稱之為“酒糟鼻”。臨床可見于各個年齡段，以20-50歲的中年女性為最為多見[2]。本病可見暫時或反復發作的紅斑、毛細血管擴張、皮膚敏感等癥狀，亦可見痤瘡樣改變，如丘疹、膿皰等，也可累及眼部出現眼干、瘙癢、視物模糊，甚至出現肥厚增生性改變，形成鼻贅等[1]，對患者身心造成極大的痛苦。現代治療方案多為內外合治，中醫中藥在內服調理方面有獨特的優勢。研究發現，本病聯合中藥治療可有效縮短療程，提高療效，有效減輕患者臨床癥狀。此外還具有副作用低，遠期療效佳等優勢。在統計皮膚科名中醫黃鶯教授治療玫瑰痤瘡的經驗方568例中，發現其中黃芪運用次數最多，共計達324次。查閱文獻也有許多醫家治療本病使用到了黃芪。黃芪首見于《神農本草經》，在臨床應用廣泛。中醫認為，黃芪性微溫，味甘，歸肝、肺、腎、脾經。具有補氣、固表、利水消腫、托毒排膿、斂瘡生肌等功效，臨床常用于治療內傷勞倦、脾虛泄瀉、咳嗽、便血、子宮下垂、瘡瘍久不收斂等以氣虛血虧為主證的疾病，為補氣健脾之要藥[3]。西醫研究發現，黃芪的主要成分包括黃芪多糖、黃酮類、皂苷類、氨基酸、微量元素等，以皂苷類為主要有效成分。現代藥理研究發現黃芪具有調節免疫、缺血保護、心臟保護、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用[4]。張小鴻[5]等研究發現，黃芪能有效改善網狀內皮細胞的吞噬功能，使血液中白細胞數量增加。趙蓮芳[6]等也證實了黃芪能大幅度提高巨噬細胞的吞噬能力。高鵬[7]等則發現不同劑量下的黃芪對巨噬細胞影響不同，具有雙向調整免疫的功能。也有研究指出，黃芪多糖能夠有效改善患者的疲勞，增強機體耐缺氧能力和應急能力[8]。徐荔[9]等發現，黃芪多糖能抑制LPS誘導的巨噬細胞產生炎癥因子，進而提高機體的抗炎癥反應。此外呂興萍[10]等也發現黃芪多糖能抑制金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌等的生長。可見黃芪有良好的調節免疫及抗炎作用，這些都對玫瑰痤瘡有良好的治療作用。但黃芪成分多，作用靶點繁雜，故找到其有效成分的對應治療靶點有利于臨床探究其作用機制及開展進一步研究。

網絡藥理學為目前研究熱點，可通過數據分析多方面挖掘藥物治療疾病的潛在機制。目前雖通過中醫理論系統及臨床應用證明了黃芪在玫瑰痤瘡治療中的有效性，但尚未明確其主要有效成分及機制。故本研究將通過網絡藥理學，篩選藥物有效活性成分，并建立“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網，分析其作用靶點，尋找黃芪治療玫瑰痤瘡的潛在機制，為后續進一步研究提供基礎。

1 方法

1.1 篩選黃芪有效活性成分及玫瑰痤瘡靶蛋白

通過TCMSP數據庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)收集黃芪有效成分，以OB (生物利用度)>30%，DL (藥物相似度)>0.18為篩選條件，得到黃芪有效活性成分共20個，查詢其對應靶點，共143個。在Gene Cards數據庫(https://www.Genecards.org/)、OMIM數據庫(https://omim.org/)檢索玫瑰痤瘡及皮膚病的相關疾病靶點，獲得靶點共545個，與黃芪有效成分的靶點取交集，得到靶點37個。使用 Cytoscapev 3.8.2軟件構建“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”可視化聯系。

1.2 構建蛋白-蛋白相互作用網絡(PPI)

將1.1中獲得的交集靶點及對應成分分別導入String數據庫(https://string-db.org/cgi/)，獲得“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網，并分析構建蛋白-蛋白相互作用網絡(PPI)。按Degree由大到小排序，選擇前30位靶點為潛在核心靶點。

1.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將1.2篩選出的核心靶點導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)，以人類為研究對象進行GO (gene ontology)注釋和KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，并設置將P值小于0.01。其中GO分析包括生物過程(BP)、細胞成分(CC)和分子功能(MF)。

2 結果

2.1 黃芪有效成分及靶蛋白分析

通過TCMSP數據庫檢索“黃芪”，以OB (生物利用度)>30%，DL (藥物相似度)>0.18為篩選條件，得到黃芪有效活性成分共20個(詳見表1)，查詢有效活性成分對應的靶點，共得到143個靶點。在Gene Cards、OMIM數據庫中分別檢索rosacea (玫瑰痤瘡)、skin (皮膚)，將所得靶點整合統計取并集后，共得到545個靶點。通過PERL將黃芪有效活性成分靶點與疾病靶點取交集，共獲得37個靶點(詳見圖1)，對應13種活性成分。主要包括華良姜素，常春藤皂苷，異鼠李素，美迪紫檀苷，7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇，(6aR,11aR)-3羥-9，10-二甲基氧紫檀-3-O-b-D-葡萄糖苷(黃酮類化合物)，聯苯雙酯，O-甲基異黃酮，毛蕊異黃酮，槲皮素，山奈酚及1,7-Dihydroxy-3,9-dimethoxy pterocarpene。其中Degree排名前五位成分為槲皮素、山奈酚、7-O-甲基異木糖醇、異鼠李素、毛蕊異黃酮(詳見表2)，這些可能為黃芪治療玫瑰痤瘡的關鍵有效成分。通過Cytoscapev 3.8.2軟件構建“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網絡(詳見圖2)。

圖1 Venny圖

圖2 黃芪治療玫瑰痤瘡的“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網

表1 TCMSP數據庫檢索“黃芪”有效成分

表2 黃芪關鍵有效成分

2.2 構建蛋白-蛋白相互作用網絡(PPI)

將重合的37個靶點導入String數據庫(https://string-db.org/cgi/)獲得“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網，并構建蛋白-蛋白相互作用網絡(PPI)(詳見圖3)。按Degree由大到小排序，篩選出前30個作為潛在核心靶點(詳見圖4)。將核心靶點對應的有效成分與2.1所獲得的黃芪治療玫瑰痤瘡可能有效成分取交集，獲得潛在有效成分13個，按Degree大小排序，推測槲皮素、山奈酚、7-O-甲基異木糖醇、異鼠李素、毛蕊異黃酮為黃芪治療玫瑰痤瘡的關鍵有效成分。

圖3 黃芪治療玫瑰痤瘡靶點PPI圖

圖4 Degree前30個靶蛋白

2.3 基因功能及通路分析

通過DAVID數據庫對篩選出的黃芪治療本病的30個核心靶點進行分析，根據P<0.01，共得到56個GO注釋，113個KEGG通路。按P值大小，篩選出前20個GO注釋(詳見圖5)。

圖5 黃芪治療玫瑰痤瘡核心靶點GO注釋

表中GO注釋6個與BP有關，14個與MF有關，提示GO注釋大多與BP、MF相關，如細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、信號受體激活劑活性、細胞粘附分子結合等。

KEGG結果則提示這30個核心靶點主要富集在34條通路上，主要集中于AGE-RAGE信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化、脂質與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、Th17細胞分化、腫瘤壞死因子信號通路、PI3K-Akt信號通路、冠狀病毒病、MAPK信號通路、肺結核、甲型流感、HIF-1信號通路等。按P值大小排列，篩選出前20條通路，詳見圖6、7。

圖6 黃芪治療玫瑰痤瘡核心靶點KEGG通路分析

3 討論

3.1 黃芪治療玫瑰痤瘡的關鍵有效成分

圖7 KEGG通路分析

近年來，有許多文獻及醫家經驗驗證了黃芪應用于玫瑰痤瘡的有效性，研究顯示，黃芪能有效改善患者臨床癥狀，縮短療程。但關于黃芪治療玫瑰痤瘡的關鍵有效成分及作用機制均無相關文獻報道。本研究通過網絡藥理學完善了“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網，并構建了蛋白-蛋白相互作用網絡(PPI)，結果得到黃芪的13種活性成分，分別對應37個作用靶點。根據Degree篩選出前5種成分作為關鍵有效成分，即槲皮素、山奈酚、7-O-甲基異木糖醇、異鼠李素、毛蕊異黃酮。其中槲皮素及山奈酚最有可能作為核心有效分子起治療作用。槲皮素是天然黃酮化合物，研究發現槲皮素具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗菌、抗炎及神經保護等多種作用，而調節炎癥是其最核心最顯著作用之一[11]。目前已有很多研究證明槲皮素在體外體內均可抑制炎癥細胞因子及相關酶，進而產生炎癥抑制作用。雖然槲皮素生物利用度較低，易轉化為各類衍生物，但其抗炎效益并未因此衰減[12]。周霄楠[13]等在使用槲皮素處理脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞瘤細胞系細胞炎癥模型中發現，槲皮素可降低炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10的表達。Kleemann R[14]等也證實槲皮素可通過降低IL-1R、Ccl8、IKK、STAT3等炎癥因子的基因表達來改善血管炎癥。此外槲皮素也是一種植物源殺菌劑，在體內外有較強的抑菌作用，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、腸球菌和沙門氏菌等均有良好的抑制性[15-16]。王兆東[17]等則發現槲皮素可通過雌激素受體/β-catenin/c-Myc信號通路促進表皮干細胞增殖，進而促進皮膚創口的修復。山奈酚也是黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種功能[18]。Kowalski J[19]等研究顯示，山奈酚能抑制巨噬細胞的表達，減少釋放IL-1β、TNF-α等炎癥因子。也有研究發現，山奈酚能顯著抑制LPS誘導的人單核細胞THP-1的MAPK通路的表達，降低MDC、IP-10、IL-8等炎癥因子的產生[20]。此外，山奈酚還具有免疫抑制作用，可以有效減少T淋巴細胞過度活化和增殖[21]。

目前主流思想認為玫瑰痤瘡發病是由綜合因素所致，以免疫機制、炎癥反應及屏障破壞為主要發病機制。玫瑰痤瘡患者皮膚常見IL-1、IL-6等炎癥介質釋放增加，伴隨蠕形螨及多種細菌感染[22]。Brown[23]等也發現玫瑰痤瘡患者局部皮損有大量T細胞及B細胞浸潤，提示免疫因素也誘發加重本病。槲皮素及山奈酚均有良好的抗炎抗菌作用，而槲皮素還可促進表皮干細胞增殖，可促進表皮修復。山奈酚抑制T細胞過度活化也可一定程度上減輕癥狀。兩者在治療玫瑰痤瘡上均有一定理論基礎，有很好的應用前景。其余幾種成分在皮膚疾病方面報道較少，故暫不考慮作為主要有效成分探究，本研究可為后期深入探討黃芪治療玫瑰痤瘡的有效成分作為理論參考。

3.2 黃芪治療玫瑰痤瘡的核心靶點

對黃芪治療中涉及的37個核心靶點進行PPI網絡構建分析，按Degree大小篩選出前30個核心靶點(詳見圖2)，主要包括血管內皮生長因子-A (VEGFA)、白介素-6(IL-6)、白介素-1B (IL-1B)、絲裂原激活蛋白激酶8(MAPK8)、白介素-8(IL-8)、表皮生長因子受體(EGFR)、白介素-4(IL-4)、干擾素(IFNG)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(CASP3)等，故推測這些靶點可能在黃芪治療玫瑰痤瘡中發揮重要作用。VEGF是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，而VEGFA是其中典型成分，可促進新生血管形成及使血管通透性增加。基因學研究發現，玫瑰痤瘡患者參與血管調節及某些神經源性炎癥的相關基因有大幅度的上調，表現出血管收縮的不穩定[24]。Anatte[25]等研究發現玫瑰痤瘡患者皮損處表皮及上皮細胞可見VEGF受體表達增加。目前研究證也發現，玫瑰痤瘡患者表現出IL-18等因子下調，IFN-γ高表達，以及IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥介質釋放增加[22]。而槲皮素及山奈酚均有抑制多種炎癥因子等作用，故這些靶點可能是探究黃芪治療玫瑰痤瘡的關鍵。

3.3 主要富集通路

GO功能注釋分析結果顯示黃芪可能在細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、信號受體激活劑活性、細胞粘附分子結合等方面起關鍵作用，發揮促進機體免疫功能，減輕炎癥等作用。KEGG通路結果提示黃芪靶點主要富集于流體剪應力與動脈粥樣硬化、脂質與動脈粥樣硬化、AGERAGE信號通路、IL-17信號通路、乙型肝炎、Th17細胞分化、腫瘤壞死因子信號通路、冠狀病毒等通路上。這些通路都較為復雜，包括多個下游通路。其中顯著性最高的流體剪應力與動脈粥樣硬化通路中，涉及到了VEGFR (內皮細胞生長因子)、VCAM-1(血管細胞粘附分子-1)、IL-1(白介素-1)、IFN-γ (干擾素-γ)、TNF-α (腫瘤壞死因子-α)等分子，有研究證實玫瑰痤瘡的發病與這些炎癥介質密切相關[22]。Y?ld?z Hayran[26]等采用通道對照試驗也證實了VFGF基因+405C/G多態性將增加玫瑰痤瘡的風險。此外也有研究提出玫瑰痤瘡與心血管疾病的某些風險因素顯著相關，包括高血壓、血脂異常及代謝綜合征[27]，故脂質與動脈粥樣硬化通路與玫瑰痤瘡的發病也可能有一定關聯性。AGE-RAGE信號通路雖是糖尿病相關通路，但可刺激產生大量黏附分子、生長因子、促炎細胞因子(如IL-6、IL-8、TNF-α) 等，引起慢性細胞活化和組織損傷，導致細胞凋亡、炎癥產生。此通路還可促進VCGF生成，引起血管通透性增加[28]。IL-37又稱抗菌肽，是玫瑰痤瘡發病中的關鍵因素，既可以誘發VEGF高表達，引起血管活性和白細胞趨化活性的作用；又增加IL-1β的釋放，協同發揮血管活性作用，而活化的IL-1β可進一步誘導IL-8、TNF、COX-2增加，引起炎癥反應[22]。Buhl[23]等在轉錄組研究中也發現玫瑰痤瘡患者的Th1細胞因子、IFN-γ、TNF-α的相關基因及 Th17細胞因子IL-17A、IL-22相關基因均呈現出普遍高表達。故上述通路均與玫瑰痤瘡的發生發展密切相關。

綜上所述，本文通過網絡藥理學對黃芪治療玫瑰痤瘡的主要有效成分及作用機制進行了初步分析，發現其具有多靶點、多通路、多成分的特點，初步闡述了黃芪治療玫瑰痤瘡的核心活性成分，潛在作用靶點及通路，靶點之間的相互聯系等，為下一步研究黃芪治療玫瑰痤瘡提供了思路及理論基礎，也有助于指導臨床藥物的使用。