薏苡仁-白花蛇舌草-莪術治療乳腺癌的網絡藥理學研究

孫楊，丘嫦，毛思穎

(廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510120)

0 引言

乳腺癌是全球發病率最高的惡性腫瘤之一，也位列中國女性惡性腫瘤發病率首位，并且一直呈現上升趨勢[1]。隨著乳腺癌早期診斷的進步和內分泌、靶向藥物的蓬勃發展，發達國家20年來乳腺癌死亡率逐漸下降，但近年來下降趨勢明顯放緩[2]，很大原因是缺少能進一步改善生存的新藥。既往乳腺癌藥物的研發是建立在“單基因-單藥物-單疾病”的邏輯基礎上，但Hopkins指出疾病表型的體現大多是多基因網絡作用的結果，很少由單基因單靶點決定，建議藥物的研發要轉換到“多成分多靶點”思路[3]，這與中醫藥復方理論有異曲同工之意，通過中藥多個有效成分與疾病多個靶點的相互作用，形成關聯網絡，使病理條件下機體的多個非平衡狀態調節到新的平衡狀態，最終達到治愈疾病的目的[4]。因此，結合網絡藥理學的哲學原理，探索中醫藥治療乳腺癌的多成分多靶點相關作用成為挖掘中醫藥療效的新方法。

在中醫藥抗乳腺癌領域，全國名中醫林毅教授深耕多年，結合地域及腫瘤特點，提出了乳腺癌的病因病機為“正氣虧虛為本，氣滯、血瘀、痰凝、邪毒內蘊為標，其中又以痰瘀互結在乳腺癌發病機制中占重要地位”[5]，祛邪藥對以“薏苡仁-白花蛇舌草-莪術”為主，具有嶺南特色和良好療效，通過網絡藥理學方法分析上述藥對抗乳腺腫瘤的分子機制，可以為進一步進行基礎研究提供方向。

1 材料和方法

1.1 “薏苡仁-白花蛇舌草-莪術”的活性化合物及作用靶點篩選

通過中醫藥系統藥理學平臺TCMSP尋找“薏苡仁-白花蛇舌草-莪術”藥對的活性化合物成分，篩選口服利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18的具有較好成藥性的活性化合物，進一步獲得活性化合物所作用的蛋白質靶點，結合PubChem和已發表的文獻報道補充活性化合物的已知靶點。通過蛋白質數據庫UniProt規范靶蛋白所對應的人類基因名稱。

1.2 乳腺癌的疾病相關靶點篩選

以“Breast Cancer”“Breast Carcinoma”“Breast Neoplasm“為關鍵詞在GeneCards數據庫、OMIM 數據庫搜索乳腺癌的潛在靶點，在DRUGBANK數據庫尋找乳腺癌治療藥物的作用靶點予以補充。GeneCards數據庫中，Score值代表了基因與疾病關系的密切程度，因此，我們將聚焦主要矛盾原則，選取Score高的相關靶點。

1.3 構建藥物活性成分-疾病靶點PPI網絡

為明晰藥物相關靶點與乳腺癌疾病靶點間的相互作用，將二者靶點取交集并繪制韋恩圖。將交集靶點導入STRING11.0 數據庫構建蛋白互作(PPI)網絡，最小互相作用閾值設定為“highest confidence”(>0.9)，其余均為默認設置，得到 PPI 網絡。將PPI網絡導入Cytoscape 3.7.2軟件行拓撲分析，根據介度、緊密度、連接度值，遴選“薏苡仁-白花蛇舌草-莪術”治療乳腺癌的核心靶點；通過MCODE插件對PPI網絡進一步分析，得到核心蛋白質功能模塊，分析核心模塊參與的生物學進程。

1.4 靶點功能與通路的富集分析及藥物成分-疾病靶點-信號通路網絡構建

將“薏苡仁-白花蛇舌草-莪術”治療乳腺癌的靶點導入Metascape平臺，設置P<0.01，進行GO和KEGG分析。將結果數據錄入CytoScape3.7.2構建成分-靶點-通路網絡圖，展現其相互關系。

2 結果

2.1 “薏苡仁-白花蛇舌草-莪術”的活性化合物及作用靶點篩選

篩選出活性成分共12個，其中薏苡仁6個，白花蛇舌草5個，莪術2個，1個成分為薏苡仁、白花蛇舌草共有(見表1)。薏苡仁作用靶點44個，白花蛇舌草作用靶點260個，莪術作用靶點23個，合并去重后靶點187個。

表1 “薏苡仁-白花蛇舌草-莪術”活性成分基本信息

2.2 乳腺癌的疾病相關靶點篩選

在GeneCards數據庫檢索出乳腺癌相關靶點基因14630個，其Score值區間范圍廣(440.05-0.08)，我們選取了前1/16位 數 的 靶 點(Score≥21.22)共919個，從OMIM和DRUGBANK數據庫分別找到496個和128個靶點，將上述靶點進行合并后去除重復值，最終得到1367個疾病靶點。

2.3 構建藥物活性成分-疾病靶點PPI網絡

將“薏苡仁-白花蛇舌草-莪術”活性成分靶點與乳腺癌疾病靶點取交集，繪制韋恩圖，篩選出二者的共同靶點95個(見圖1)。

圖1 “薏苡仁-白花蛇舌草-莪術”成分靶點與乳腺癌靶點的韋恩圖

將藥物疾病共同靶點輸入String在線數據庫，獲得PPI網絡，將網絡導入Cytoscape 3.7.2軟件制作預測靶點互作圖(見圖 2)。該網絡共有92個節點，374條邊，平均度值為14.5，大于平均度值的靶點有13個(見表2)。其中排名前7位的TP53、AKT1、MAPK1、JUN、RELA、IL6、TNF靶點的度值超過22，可能為薏苡仁-白花蛇舌草-莪術治療乳腺癌的關鍵靶點。應用Cytoscape的MCODE插件來查找PPI網絡中最重要的模塊，即PPI中密度最高的區域，該模塊由22個節點和64條邊組成(見圖3)，根據P值，保留核心模塊5個最佳評分的生物學進程對其進行功能描述，主要涉及細胞黏附調節和凋亡方面(見表 3)。

表2 “薏苡仁-白花蛇舌草-莪術”治療乳腺癌核心靶點及其拓撲參數

表3 MODULE網絡的生物學進程功能描述

圖2 “薏苡仁-白花蛇舌草-莪術”治療乳腺癌的高置信度靶點互作網絡

圖3 PPI網絡中的MODULE

2.4 藥物與疾病交集靶點的富集分析及化合物-靶點-通路網絡構建

通過GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，得出交集蛋白在細胞中的功能及所涉及的信號通路等。薏苡仁-白花蛇舌草-莪術主要參與的生物學過程包括凋亡信號通路、有毒物質的應答、細胞死亡的正向調節等(見圖4 A)，參與的主要通路有腫瘤通路、AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、MAPK信號通路等(見圖4 D)。運用CytoScape3.7.2構建薏苡仁-白花蛇舌草-莪術的藥物成分-靶點-通路網絡(見圖5)，深藍箭頭代表通路，淺藍六邊形代表靶點，中央圓形為藥物成分，主要的藥物活性成分有：槲皮素、β-谷甾醇、雙去甲氧基姜黃素。

圖4 藥物抗癌靶點的富集分析

圖5 “薏苡仁-白花蛇舌草-莪術”治療乳腺癌的“化合物-靶點-通路”網絡

3 討論

薏苡仁、白花蛇舌草、莪術是林毅名中醫治療乳腺癌的常用攻邪藥組，是結合嶺南多濕特點及乳腺癌“痰瘀互結”的病理本質而配伍，有健脾滲濕、清熱解毒、破血散結的作用。這三種藥物中具備多種抗腫瘤作用的有效成分，其中，槲皮素、β-谷甾醇、雙去甲氧基姜黃素等成分與乳腺癌的關系更為密切。有研究證實，槲皮素可通過Akt-mTOR途徑介導的自噬誘導抑制細胞遷移和糖酵解來抑制乳腺癌的進展[6]，此外還具有抗炎，抑制血管生成等抗腫瘤作用[7]。β-谷甾醇能有效削弱乳腺癌MCF7誘導腫瘤的生長[8]，機制是通過抑制PI3K，p-Akt，Bcl-2家族成員和其他參與PI3K-Akt介導的線粒體信號傳導途徑的因子表達。雙去甲氧基姜黃素可通過調節p53/p21和p16/Rb途徑誘導ROS積累來抑制MCF-7細胞活力[9]。

TP53、AKT1、MAPK1、JUN、RELA、IL6、TNF是藥對的關鍵靶點。眾所周知，TP53是抑癌基因，參與調控細胞周期進程、維護DNA和基因組完整性、DNA損傷后的修復和凋亡。而AKT是乳腺癌重要的驅動基因，激活后可催化100多種底物，參與調控乳腺癌的增殖、生存、遷移和轉移等方面，AKT1作為AKT的主要亞型之一，主要起促進乳腺腫瘤發生的作用，具體機制是通過細胞周期蛋白(例如p21，p27和cyclin D1)增加細胞增殖，通過P53抑制細胞凋亡[10]。MAPK1(ERK2)有促進腫瘤發生發展及引發耐藥的作用，可被雌激素快速激活[11]，雌激素相關受體γ蛋白水平受ERK/MAPK激活狀態的影響，如ERK靶點突變可削弱了ERRγ驅動轉錄活性，引起他莫昔芬的耐藥性[12]。雌激素受體能夠調節AP-1響應基因轉錄而無需直接與DNA相互作用，與Fos/JUN家族成員之間通過蛋白質相互作用產生crosstalk，從而促進腫瘤增殖[13]。TNF、白介素-6 (IL-6)等細胞因子存在于腫瘤微環境和腫瘤轉移部位中，已被報道與乳腺癌的發生有關[14]。

薏苡仁-白花蛇舌草-莪術治療乳腺癌的主要信號通路，除腫瘤通路外，AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、MAPK信號通路與炎癥氧化應激關系密切。如AGEs與RAGE的結合可以增加ROS水平，進而激活MAPK/NF-κB信號通路，產生IL6、TNF等炎癥因子，延長導致腫瘤升高的炎癥，增加癌癥的發展[15]。流體剪切應力(FSS)同樣可以通過ROS操縱細胞信號通路引起炎性因子釋放，促進癌細胞的生長和存活，細胞外信號調節激酶(ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路調控癌細胞的細胞周期和增殖，是研究最多的FSS相關癌癥病理通路之一[16]。

本研究通過網絡藥理學方法，對薏苡仁-白花蛇舌草-莪術治療乳腺癌的作用機制進行了初步探討。結果顯示，薏苡仁-白花蛇舌草-莪術可通過槲皮素、β-谷甾醇、雙去甲氧基姜黃素等多種活性化合物，作用于TP53、AKT1、MAPK1、JUN、RELA、IL6、TNF等靶點，調控腫瘤通路、AGERAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、MAPK信號通路等等多條通路，實現對乳腺癌的治療，體現了其作用多成分、多靶點、多通路的特點。本研究不足之處在于僅能以已知類藥性成分數據進行生信分析，后續還要在此基礎進行動物或細胞實驗驗證，進而明晰藥物治療疾病的靶點及機制。