香葉木素對小鼠缺氧耐受和抗疲勞影響的實驗研究

楊正蓉，李濤，李成良，盧鎮江，宋夢強，鄭倩

(1.川北醫學院，四川 南充 637100；2.川北醫學院基礎醫學院機能實驗中心，四川 南充 637100)

0 引言

香葉木素主要從菊花、留蘭香、蜘蛛香等天然藥物和檸檬、柑橘、花生等天然黃酮類化合物果實中提取的黃酮類化合物[1]。香葉木素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎及抗菌等多種藥理活性[2]。有實驗證明其對可保護小鼠缺血再灌注誘導的急性腎損傷[3]，同時可保護視網膜功能，機制與減少DNA損傷和降低氧化應激反應有關[4]。近期有實驗結果表明香葉木素可通過增加SOD活性和減少MDA含量從而對大鼠腦缺血再灌注損傷有保護作用[5]。目前香葉木素對耐缺氧和抗疲勞的作用及其機制的報道較少，本課題通過不同濃度香葉木素對小鼠進行灌胃，建立低張性缺氧、亞硝酸鈉缺氧、急性腦缺血性缺氧模型，觀察各組小鼠存活時間，同時觀察香葉木素對小鼠負重游泳和爬桿實驗的時間變化，并檢測小鼠肝臟中S0D、MDA的變化，以此探討香葉木素對耐缺氧和抗疲勞的作用及其相應機制，為開發香葉木素的應用提供理論基礎和實驗數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

1.1.1 實驗動物

選擇健康KM成年小鼠75只，體重為24-28g，全為雄性，小鼠由川北醫學院動物實驗中心提供。飼養在溫度為26℃的環境中。普通飼料由川北醫學院動物實驗中心動物房提供，常溫避光保存。

1.1.2 分組

將小鼠隨機分成3組：對照組(NOR)、低劑量組香葉木素10mg/(kg·d)、高劑量組香葉木素50mg/(kg·d)，香葉木素組每天16時給小鼠灌胃，連續 25d。對照組灌胃生理鹽水，按體重于每天16時灌胃0.1mL/kg 生理鹽水，持續25d。

1.2 實驗儀器及試劑

試劑 香葉木素(YM190207A03)、總超氧化物歧化酶(TSOD)測試盒(南京建成，A001-1)，丙二醇(MDA)測試盒(南京建成，A003-1)，BSA標準品、BCA工作液。

實驗儀器 缺氧瓶、灌胃針、離心管、微孔板、組織研磨器、離心機、恒溫水浴箱、玻璃棒、水池。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠低張性缺氧實驗

三組小鼠最后一次灌胃30min后，每組隨機選出5只小鼠分別放進盛有5g鈉石灰的廣口瓶中。用凡士林涂抹瓶口周圍，確保廣口瓶的密閉性，隨后觀察小鼠存活狀態，記錄小鼠死亡時間(判斷標準：胸口不再起伏)，用此來作為小鼠常壓耐缺氧時間。

1.3.2 小鼠亞硝酸鈉中毒缺氧實驗

三組小鼠最后一次灌胃30min后，隨機選出5只小鼠，各組小鼠腹腔注射5%亞硝酸鈉(0.1mL/10g)，注射后觀察小鼠生存情況直至小鼠呼吸停止，記錄死亡時間。

1.3.3 急性缺血缺氧實驗(斷頭)

三組小鼠最后一次灌胃30min后，每組隨機選出5只小鼠，自頸部斷頭，記錄小鼠斷頭后出現張口喘息至停止呼吸的時間。

1.3.4 小鼠負重游泳

三組小鼠最后一次灌胃30min后，每組隨機選出5只小鼠，將小鼠放入水槽，進行游泳實驗，水溫(25±2)℃，將自身體重8%鉛絲重物綁的位置在尾部1/3-2/3處，且系重物繩子不能接觸桶底，在整個實驗過程每只小鼠四肢不停運動，用秒表準確記錄小鼠力竭游泳時間，小鼠入水至頭部全部入水持續 8S內不能浮出水面為止表示為力竭游泳時間。

1.3.5 小鼠爬桿實驗

三組小鼠最后一次灌胃30min后，每組5只，桿光滑，長100cm、直徑7mm，垂直懸掛，將經訓練篩選過的小鼠分別放在玻璃棒上端，記錄小鼠肌肉疲勞乏力而無法抱住玻璃棒上端最終落下的時間，反復3次。

1.3.6 小鼠肝臟SOD活性和MDA含量測定

小鼠低張性缺氧死亡后迅速解剖并制備肝臟勻漿。方法為取出小鼠肝臟，稱重0.2g，用移液管盛入9倍的0.9%的Nacl溶液，將剪碎的肝臟組織放入到離心管中，用研磨槍充分研磨直至成勻漿，濃度為10%，勻漿離心10min (3000r/min)，取上清液分裝待用。根據SOD試劑盒說明書和MDA試劑盒說明書操作和計算[6]。

1.4 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用(±s)表示，比較采用t檢驗；計數資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度香葉木素對小鼠低張性缺氧模型的影響

結果如表1，給予小鼠香葉木素灌胃25天后，與NOR相比較，香葉木素低劑量小鼠存活時間由(7.34±0.21) min增加(10.78±0.45) min，差異有統計學意義；高劑量組亦明顯延長小鼠低張性缺氧存活時間(P<0.05)，差異具有統計學意義。

表1 香葉木素對小鼠低張性缺氧、亞硝酸鈉和急性缺血缺氧的影響(±s，min)

表1 香葉木素對小鼠低張性缺氧、亞硝酸鈉和急性缺血缺氧的影響(±s，min)

注：與NOR 比較P<0.05，#P>0.05。

組別 低張性缺氧存活時間 亞硝酸鈉中毒性缺氧存活時間 急性缺血缺氧實驗NOR 7.34±0.21 24.73±1.64 19.30±0.62低劑量香葉木素組 10.78±0.45* 25.02± 2.37# 26.72+3.02*高劑量香葉木素組 12.04±1.03* 30.35± 2.51* 30.42+2.28*

2.2 不同濃度香葉木素對小鼠亞硝酸鈉中毒性缺氧的影響

與正常組比較，香葉木素低劑量組能延長小鼠亞硝酸中毒缺氧耐受的時間，但不具有統計學意義，高劑量組能延長存活時間，差異有統計學意義(P<0.05)，結果見表1。

2.3 香葉木素對小鼠急性缺血缺氧的影響

結果見表1，高、低劑量香葉木素組小鼠急性缺血缺氧存活時間與NOR組相比顯著增加，小鼠斷頭后張口呼吸時間明顯延長(P<0.05)，說明香葉木素能提高小鼠急性缺血缺氧的存活時間。

2.4 不同濃度香葉木素對小鼠負重游泳的影響

給予小鼠灌胃香葉木素 25天后，高，低劑量香葉木素兩組小鼠負重游泳時間與NOR組明顯提高，差異有統計學意義(P<0.01)，結果見表2，低劑量香葉木素組小鼠負重游泳時間由(96.4±13.50) s增加至(328.25±18.03) s，提高率為70.63%；高劑量香葉木素組負重游泳時間(96.4±13.50) s增加至(423.65±30.26) s，提高率為77.24%。

2.5 不同濃度香葉木素對小鼠爬桿實驗的影響

給予小鼠灌胃香葉木素 25天后(結果見表2)，與正常組比較，低劑量香葉木素組爬桿時間明顯延長，由(74±8.48) s增加到(102.52±12.05) s，P<0.05；高劑量組增加到(386.16±24.22) s，P<0.01，差異有統計學意義。

表2 香葉木素對小鼠爬桿實驗和負重游泳實驗的影響(±s，s)

表2 香葉木素對小鼠爬桿實驗和負重游泳實驗的影響(±s，s)

注：*與NOR 比較P<0.05，※P<0.01。

組別 爬桿時間 游泳時間NOR 74±8.48 96.4±13.50低劑量香葉木素組 102.52±12.05* 328.25±18.03※高劑量香葉木素組 386.16±24.22※ 423.65±30.26※

2.6 不同濃度香葉木素對各組小鼠肝組織勻漿中MDA含量和 SOD活性的影響

如表3所示高、低劑量香葉木素組小鼠肝臟勻漿MDA含量明顯減少，NOR組小鼠肝臟中的MDA含量高于高、低劑量香葉木素組(P<0.05)，差異有統計學意義。與NOR組小鼠肝臟的SOD活性相比，高、低濃度香葉木素組明顯降低，統計學有意義P<0.05。

表3 不同濃度香葉木素對小鼠肝臟SOD活性、MDA的影響(±s)

表3 不同濃度香葉木素對小鼠肝臟SOD活性、MDA的影響(±s)

注：SOD:超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛，*P<0.05, 與NOR比較。

組別 例數SOD活性(μ/mL) MDA(nmol/L)NOR 5 156.21±10.06 5.92±1.26低劑量香葉木素組 5 202.53±18.12* 3.36±0.06*高劑量香葉木素組 5 265.04±20.03* 2.92±0.08*

3 討論

缺氧是因組織氧氣供應不足或者利用氧氣出現障礙而產生組織代謝、功能和形態結構發生異常變化的病理過程，嚴重缺氧會引起心和腦等重要器官的不可逆的損傷，最終導致機體死亡[7]。本實驗采用低張性缺氧、亞硝酸鈉中毒性缺氧以及急性腦缺氧實驗模型觀察香葉木素對缺氧耐受的影響，低張性缺氧為非特異性缺氧，亞硝酸鈉中毒屬于組織細胞外液缺氧，亞硝酸鈉可使血紅蛋白中二價鐵氧化為三價鐵，變成高鐵血紅蛋白，從而失去攜帶氧氣的能力，引起組織細胞缺氧。在急性腦缺血缺氧試驗中，由于腦組織缺乏血液供應，呼吸只能利用自身存儲氧氣短暫維持，從而表現為張嘴喘氣。本試驗結果顯示，與NOR組比較，香葉木素低劑量組和高劑量組可以明顯延長低張性缺氧、亞硝酸鈉中毒性缺氧以及急性缺氧條件下小鼠存活時間，具有統計學意義，說明其對心臟和腦缺氧具有改善作用，并提高心腦組織對缺氧的耐受。

疲勞是機體由于長時間或過于繁重的腦力和體力勞動而引起的工作效率暫時降低的一種生理心理現象[8]，運動性疲勞是由機體一系列生化改變導致的肌肉收縮力降低而產生的，是最直接和最客觀的機體運動耐力的降低表現[]，力竭游泳和爬桿時間一直以來被作為反映運動性疲勞的重要指標。本實驗結果顯示香葉木素組小鼠負重游泳時間明顯延長(P<0.05)；香葉木素組爬桿時間明顯延長(P<0.05)，實驗結果說明其有顯著的抗疲勞作用。

實驗證實缺氧可改變機體氧自由基代謝，主要表現為抗氧化能力下降和脂質過氧化反應增強。SOD是機體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用清除氧自由基的酶，可以直接反映機體抗氧化水平，與多種疾病的發生和發展關系密切[10]。MDA是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的代謝產物，其可以間接反映機體抗氧化能力及清除氧化產物的能力[11]。本實驗結果顯示結果顯示香葉木素組提高小鼠肝臟中SOD的活性(P<0.05)，小鼠肝臟MDA含量明顯減少(P<0.05)，結果顯示香葉木素能增強肝臟內SOD的活性，降低MDA含量，從而減輕損傷。

本實驗結果說明香葉木素有良好的缺氧耐受和抗疲勞作用，其作用機制與抗氧化有關，本實驗為香葉木素的開發和應用提供實驗基礎。