金胺O熒光染結核桿菌褪色后行抗酸染色的結果分析

陳丹丹

(聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院，福建 福州 350001)

0 引言

近年來我國的結核病發(fā)病率呈增加趨勢，而在臨床判斷結核病過程中，現(xiàn)以病理組織學的鏡下結果，即典型病變部位行HE染色后可見朗格漢斯巨細胞，類上皮細胞及干酪樣壞死組成的結核肉芽腫為特征和萋尼氏抗酸染色(Ziehl-Neelsen染色)作為其診斷的金標準[1-2]。對結核病人來說，及早快速的檢出結核分枝桿菌，有助于其得到早期有效的治療效果。現(xiàn)階段，抗酸染色由于其具有特異性強，操作簡單等優(yōu)點，常用于臨床診斷，尤其適合用于基層醫(yī)療單位診斷結核分枝桿菌感染病例[3]，金胺O熒光染色由于其敏感性較高，多用于抗酸染色的輔助診斷[4]。但由于金胺O熒光染色具有高敏感性，人員培訓周期短等優(yōu)勢，現(xiàn)階段，對臨床疑似病例，多在第一時間就選取典型部位進行切片，進行金胺O熒光染色后得出診斷結果。但是，經(jīng)長期多次實驗發(fā)現(xiàn)，金胺O熒光染色存在假陽性的情況發(fā)生，易造成誤診。不僅僅延長病人的診斷周期，導致錯誤用藥，同時也造成試劑浪費情況，增加不必要的醫(yī)療費用。如若疑似部位結核分枝桿菌存在范圍小，多次制片將大大消耗待檢組織。此時，在不易獲得多個切片的情況下，可將經(jīng)金胺O熒光染色的染色切片進行褪色處理可獲得相同部位的抗酸染色結果。本實驗選取疑似結核桿菌的病人，經(jīng)金胺O熒光染色得出結果，而后對原有染色切片行褪色處理后再疊加抗酸染色，并比對結果進行分析。褪色處理后的金胺O熒光染色切片可獲得真實的抗酸染色結果，不僅用于回顧性研究，必要情況下可再次驗證金胺O熒光染色結果的真實性、可靠性。

1 材料和方法

1.1 材料

2017年9月至2018年9月，我科疑為結核桿菌感染的病例196例，其中男103例，女93例，年齡25-79歲，平均43歲。所有病例皆選取典型部位的石蠟組織塊進行金胺O熒光染色，根據(jù)熒光染色的時間段，將以上病例人為的分為A(2017年9-12月)，B (2018年1-3月)，C (2018年4-6月)，D (2018年7-9月)四組。

主要儀器 熒光顯微鏡(OLYMPUS BX51)；普通光學顯微鏡(OLYMPUS BX41)；電熱恒溫水槽；

主要試劑 (1)抗酸染色檢測試劑盒購自珠海貝索生物技術公司。(2)金胺O熒光染色液：金胺0.1g溶于95%酒精10mL，脫色劑為3%鹽酸乙醇液；復染液為2.5%高錳酸鉀溶液。(3)二甲苯和梯度(100%，95%，85%)酒精。(4)使用2.5%草酸溶液和充分水洗脫去金胺O熒光染色。

1.2 染色方法

(1)金胺O熒光染色法：首先將選取典型的石蠟塊制成厚度為5μm的切片，經(jīng)二甲苯及梯度酒精脫蠟至水，后將組織切片放入金胺O熒光染液中并置于65℃電熱恒溫水槽，染色時間設置為30min。后取出切片，流水沖洗5min，水洗后用3%鹽酸乙醇液進行脫色，可根據(jù)顏色變化水洗1-3min不等，至外觀無明顯黃色為止。再次水洗后使用2.5%高錳酸鉀溶液進行復染，水洗烤干，中性樹脂經(jīng)行封片，待檢。熒光鏡下可見結核桿菌菌體在黑色背景下呈現(xiàn)亮綠色，菌體形態(tài)清晰。(2)整理2017年9月至2018年9月的金胺O熒光染色片，取下蓋玻片，至二甲苯及梯度酒精中進行短暫洗脫，流水沖洗5min。水洗結束后甩干多余液體，分別滴加足量2.5%草酸溶液，至外觀無明顯黃色為止，再次流水沖洗。(3)抗酸染色：按照Ziehl-Neelsen抗酸染色法常規(guī)操作流程進行染色，即先滴加足量石炭酸復紅染液覆蓋組織切面染色5min，該過程可進行加熱處理，即將酒精燈置于玻片架下20cm處徐徐加熱，至有少量蒸汽出現(xiàn)為止。若染液蒸發(fā)減少，徐加染液。染色過程應多于5min，待染液恢復室溫后水洗。后滴入3%鹽酸酒精液進行脫色，過程中可輕輕晃動玻片至無紅色脫出為止，水洗。最后，用美蘭染液復染1min，水洗，中性樹脂封片，待檢。結果判定：鏡下見到鮮紅色桿狀、略彎曲、串珠狀的抗酸桿菌為陽性。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用(±s)表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

本實驗選取的疑似結核分枝桿菌感染的病例共196例，其中，臨床結合病理診斷為結核分枝桿菌感染的病例共117例，設為結核組，金胺O熒光染色的陽性88例，陰性29例，陽性率為75.2%；診斷為非結核分枝桿菌感染的病例共79例，設為對照組，金胺O熒光染色陽性1例，陰性78例，陽性率為1.3%。將所有196例已金胺O熒光染色后的切片經(jīng)脫色處理后，進行Ziehl-Neelsen抗酸染色，鏡下符合結核分枝桿菌感染的共67例，陽性率為57.3%，見表1。

表1 金胺O熒光染色和褪色后行抗酸染色結果的比較[n(%)]

本實驗送檢196例病人中，男性103例，女性93例，年齡25-79歲，平均43歲。其中無論是金胺O熒光染色或是抗酸染色，兩組患者的性別和年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

本實驗根據(jù)熒光染色的時間段，將196例接受金胺O熒光染色的切片人為的分為A (2017年9-12月)，B (2018年1-3月)，C (2018年4-6月)，D (2018年7-9月)四組。經(jīng)褪色處理后，行抗酸染色發(fā)現(xiàn)，隨著時間增加，金胺O熒光效果逐漸消退，但草酸試劑褪色效果好，同時不影響抗酸染色著色效果。鏡檢時，可見淺藍色背景下，著紅色，彎曲狀的結核分枝桿菌呈灶性分布，四組染色效果相當。可推測出金胺O熒光染色結果受時間影響，新染的切片熒光強(見圖1)，可有較高的準確性，但不利于后期回顧性研究。此時褪色后行抗酸染色效果依舊，鏡檢時仍舊有良好的著色效果和較高的敏感性及準確性(見圖2)。

圖1 金胺O染色法 結核抗酸桿菌呈亮綠色彎曲狀

圖2 抗酸染色法 結核抗酸桿菌呈紫紅色彎曲狀，呈散在分布

3 討論

近年來，我國的結核病呈現(xiàn)上升趨勢，現(xiàn)階段，診斷結核分支桿菌感染過程中，金胺O熒光染色以其高敏感性，檢出率高，鏡檢時間短等優(yōu)點，已逐漸成為臨床上最常用的檢測方法[5]。在高敏感性的同時，金胺O熒光染色也存在假陽性，費用較高的弊端，不可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的抗酸染色方法。而且，由于近年來抗生素使用不當，HIV感染或環(huán)境等多種因素影響，結核分枝桿菌可發(fā)生變異，因此，病理診斷過程中行HE染色常常得到不典型的組織形態(tài)。此時，在典型病變部位的石蠟組織切片中通過萋尼氏抗酸染色(Ziehl-Neelsen染色)找到結核分支桿菌對于診斷結核病具有重要的意義。本實驗選取2017年9月至2018年9月之間疑似結核分枝桿菌感染的病人196例，經(jīng)金胺O熒光染色后，由于染色時間長導致的熒光淬滅及人為的褪色操作，后在同一組織切片上行萋尼氏抗酸染色(Ziehl-Neelsen染色)，通過比較兩種染色的敏感性及特異性，可知，兩種染色方法的符合率極高。雖然金胺O熒光染色具有高敏感性的優(yōu)點，但仍有假陽性的情況，可考慮與切片染色過程中的雜質有關[6]。此時，褪色后的金胺O熒光染色切片同樣可獲得高準確性的抗酸染色結果，并不會因切片的新舊情況而有不同染色結果，在不同的實驗條件下仍然具有可行性，可重復驗證結果的真實有效性。在疑似部位結核分枝桿菌存在范圍小，多次制片將大大消耗待檢組織的極端情況，常不易獲得多個切片，可將經(jīng)金胺O熒光染色的切片進行褪色處理已獲得相同部位的抗酸染色結果。這對于驗證少數(shù)金胺O熒光假陽性個例具有重要意義。萋尼氏抗酸染色(Ziehl-Neelsen染色)可在石蠟組織切片中找到形態(tài)各異的結核桿菌，具有高特異性，這才是診斷“金標準”。另外，抗酸染色具有保存時間長，成本低廉，操作環(huán)境簡單的優(yōu)點，適用于各級別醫(yī)療機構，使用范圍廣。

抗酸染色作為傳統(tǒng)而又經(jīng)典的手工染色，其過程中需注意許多細節(jié)。結核抗酸桿菌由于體內含脂質，蛋白質及多糖類物質，主要由于其脂質外殼使得染液無法進入，但能與苯酚和堿性復紅結合成復合物，抵抗酸性物質的脫色從而著紅色。這提醒我們，由于其不易上色和不易脫色的特點，染色結果具有不穩(wěn)定性。在實踐中，作者發(fā)現(xiàn)可改進部分操作提高其陽性率：(1)使用特殊透明劑。實驗中，用松節(jié)油為主要材料的TO生物通明劑代替二甲苯進行脫蠟[7]。此步驟可保護菌體細胞壁完整性，提高其抗酸性，尤其對菌體較少的標本更具意義。(2)染色時間的合理控制[8]。一部分，注意分化時間，過長，易使得已著色的結核分枝桿菌掉色，易漏檢；分化過短，紫紅色背景過深，同樣不易檢出。另一部分，復染時間也要適宜，可加入亞甲藍短暫染色數(shù)秒，若時間超過，也可將切片經(jīng)流水沖洗，使其脫去部分藍色。已達到良好的染色效果。(3)組織石蠟切片可適當偏厚，以5-6μm為宜，此步驟可使得切片內含較多的菌體，提高其陽性檢出率，避免漏檢[9]。