流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞亞群的常見問題及其解決方案

段萃娟，凌愛琴，張 翠，王瑞玲，宋 娜，王玉飛

淋巴細胞亞群是構成機體免疫系統的主要細胞群，參與機體細胞免疫和體液免疫，它可通過流式細胞儀被檢測，臨床上多用于監測腫瘤、感染、移植、過敏患者的免疫狀況。流式細胞儀(flow cytometer，FCM)集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體，廣泛應用于生物學及臨床醫學的研究[1-4]。本研究對解放軍總醫院第三醫學中心檢驗科2018年流式細胞儀日常檢測外周血淋巴細胞亞群過程中遇到的常見問題進行分析、總結，并提出解決方案，以提高檢測結果的準確性。

1 材料與方法

1.1 樣本與儀器設備 選取2018年檢測的淋巴細胞亞群樣本14 236例。空腹采集EDTA-K2抗凝靜脈血3 ml。使用邁瑞BriCyteE6流式細胞儀,試劑均為深圳邁瑞公司產品：四色流式試劑CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC，CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC，Flow-Count標準熒光微粒及FACS溶血素(10×)。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞儀質控測試 采用Flow-Count標準熒光微粒，通過MRFlow軟件自動完成對儀器的質量控制。

1.2.2 樣品制備 取2只檢測管，分別標記A和B，A管內加入20 μl CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC抗體，B管內加入20 μl CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC抗體，然后分別加入50 μl EDTA抗凝靜脈血至管底。試管在旋渦混勻器上輕旋混勻，室溫避光孵育15 min；向試管內加入1×溶血素450 μl，在旋渦混勻器上輕旋混勻，室溫避光孵育15 min；待紅細胞充分裂解后，渦旋混勻，分別上機檢測。

1.2.3 流式分析 應用MRFlow軟件自動分析，CD45/SSC散點圖建立P1門選中淋巴細胞，CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8、CD3/CD19、CD3/CD16+56散點圖建立十字門圈定對應區域的細胞(以CD3/CD4為例)。A管建立CD45/SSC、CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8散點圖，B管建立CD45/SSC、CD3/CD19、CD3/CD16+56散點圖，從而獲得淋巴細胞各亞群的絕對計數和百分比。

2 結 果

2.1 CD45-SSC門散點圖分群不清 正常情況下，CD45/SSC散點圖中可圈出CD45淋巴細胞(圖1A)，但是在1例腎病綜合征患者進行外周血淋巴細胞亞群檢測時，散點圖中無法圈出CD45淋巴細胞(圖1A)，絕對計數和分類結果均受影響。

2.2 十字門分類散點圖分群不清 正常情況下，CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8、CD3/CD19、CD3/CD16+56散點圖可用十字門進行明確的區域劃分(圖1)。在檢測時，經常會出現散點圖彌散、蔓延其他區域，無法明確分區的情況(圖1B)，導致淋巴細胞各亞群分類有誤，以至于各亞群絕對計數和百分比結果不準確。該種情況主要見于溶血時間不夠、紅細胞過多或病態紅細胞導致的溶血不充分。

2.3 淋巴細胞亞群無法分群 部分肝移植患者在檢測外周血淋巴細胞亞群時會出現無法分群的情況。有CD45-SSC無法分群(圖2A)，部分患者CD3、CD4、CD8、CD19及CD16+56散點圖無法分群(以CD3/CD4、CD3/CD19散點圖為例，見圖2B、3C)，而不能獲得絕對計數結果。

2.4 淋巴細胞亞群細胞絕對計數假性減低 當患者血細胞出現聚集狀態時，淋巴細胞不能充分地同特異性熒光標記抗體相結合，從而導致淋巴細胞亞群細胞絕對計數結果假性降低。圖2A就是一例不明原因無法分群而導致的絕對計數結果假性減低，在審圖時發現結果異常。

2.5 解決方案

2.5.1 上機前溶血素清洗 上機前在試管內加入雙倍體積溶血素(900 μl)，震蕩混勻，待紅細胞充分裂解管中液體變得透亮后上機檢測，同時調整儀器的體積倍數；或者加入溶血素后150 g離心5 min，小心吸取450 μl上清棄除，以保持上樣前體積倍數不變。如果結果不理想可再次重復操作。該方法主要適用于利用體積法絕對計數的流式細胞儀，可以解決其十字門分類散點圖分群不清的問題(圖1D)。

2.5.2 樣品制備前生理鹽水清洗 在樣本制備前，取200 μl全血加入800 μl生理鹽水，震蕩混勻后150 g離心5 min，小心吸取上清棄除，重復操作一次后，將剩余的200 μl沉淀混勻。此后再按照1.2.3的方法制備樣品及上機檢測。該方法可以解決高凝狀態標本、藥物等不明原因引起CD45-SSC門散點圖分群不清、淋巴細胞亞群無法分群以及淋巴細胞亞群細胞絕對計數假性減低的問題(圖1C、圖2D、圖2E、圖2F)。

3 討 論

隨著流式細胞技術的發展，流式細胞儀的應用越來越廣泛，流式細胞儀的品牌及種類也越來越多。目前流式細胞儀測量淋巴細胞亞群絕對計數的單平臺方法有兩種，一種是基于Trucount管的微球法，另一種是基于流量傳感器的體積法，這兩種方法之間具有較好的一致性[5]。我們使用的是邁瑞BriCyte E6流式細胞儀，其絕對計數方法是基于流量傳感器的體積法，具有較好的準確性和重復性[6-8]。但是，由于體積法為了保證樣本體積精確，加溶血素后直接上機，易導致檢測時出現散點圖分群不清的問題，對此，我們根據BriCyte E6流式細胞儀絕對計數原理提出了相應的解決方法：(1)上機前溶血素清洗。上機前在試管內加入雙倍體積溶血素(900 μl)，震蕩混勻，待紅細胞充分裂解管中液體變得透亮后上機檢測，同時調整儀器的體積倍數；或者加入溶血素后150 g離心5 min，小心吸取450 μl上清棄除，以保持上樣前體積倍數不變。如果結果不理想可再次重復操作。該方法主要適用于利用體積法絕對計數的流式細胞儀，可以解決其十字門分類散點圖分群不清的問題(圖1D)。(2)樣品制備前生理鹽水清洗。在樣本制備前，取200 μl全血加入800 μl生理鹽水，震蕩混勻后150 g離心5 min，小心吸取上清棄除，重復操作1次后，將剩余的200 μl沉淀混勻。此后再制備樣品及上機檢測。該方法可以解決高凝狀態標本、藥物等不明原因引起CD45-SSC門散點圖分群不清、淋巴細胞亞群無法分群以及淋巴細胞亞群細胞絕對計數假性減低的問題(圖1C、圖2D、圖2E、圖2F)。

圖1 外周血淋巴細胞亞群分群不清散點圖清洗前后對比

上機前溶血素清洗主要解決藥物、血液病等原因引起的紅細胞不完全溶血、血小板碎片過多的問題。另外，感染、炎癥、血液病等引起的白細胞增高、組織破壞引起的纖維蛋白增高也可以影響淋巴細胞亞群的檢測結果，樣品制備前生理鹽水清洗可以解決這些問題，特別是白細胞嚴重增高的標本，使用生理鹽水稀釋后根據其稀釋比例調整儀器計算體積比得到絕對計數結果。為了保證結果的可靠性，對需要清洗標本在實驗室日常使用的質控在控、運行正常的SYSMEX XN-2000全血細胞分析儀上進行檢測，并對淋巴細胞絕對值進行比較，差異無統計學意義(P>0.05)，結果具有較好的一致性(ICC=0.915，P<0.001)。

肝腎移植患者術后需要定期監測外周血淋巴細胞亞群，評估機體免疫狀態，以期為臨床進行免疫干預治療提供參考依據[9-12]。但是，移植患者，尤其是長期生存的移植受者，由于術后長期使用免疫抑制劑可能會影響到淋巴細胞亞群的檢測結果，導致淋巴細胞亞群無法分群的現象。圖2B、C即為1例肝移植術后12年的移植受者外周血淋巴細胞亞群檢測結果圖，該患者術后長期使用免疫抑制劑，突然以臨床突發蛋白尿、血尿入院，其他結果均正常。此類患者導致淋巴細胞亞群無法分群的具體原因目前尚不清楚，推測可能與外周血中存在干擾物質有關，因此通過樣品制備前生理鹽水清洗可以較好地解決該類問題。

淋巴細胞亞群細胞絕對計數假性降低多見于慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)晚期患者。在CKD患者血漿中，Fg、PT、D-D 等凝血因子升高，同時還存在TC、ET-1、Ca2+、ALB、CRP 等影響CKD 高凝狀態的危險因素[13-16]。這些可使患者的外周血細胞出現聚集狀態，從而不能充分地同抗體相結合，導致絕對計數結果假性減低(圖2A)。樣品制備前生理鹽水清洗可去除血細胞的高聚狀態，從而可以較好地解決該問題。

圖2 外周血淋巴細胞亞群無法分群散點圖清洗前后對比

邁瑞BriCyte E6流式細胞儀在進行結果分析時，需要計算標本體積和上樣管內體積之比，正常情況為1∶10.4。為防止反復清洗過程中棄除上清造成的體積不準確，在溶血素清洗過程中可以省略棄上清這一步，直接調整儀器的計算體積比從而得到可靠的計數結果。同樣，在生理鹽水清洗過程，若不能棄去與加入生理鹽水同等體積的上清，也可以根據加樣比例來調整儀器計算體積比。

由于邁瑞流式細胞儀是根據體積法進行的計數，在樣品制備過程中需要特別注意加樣的準確性，因此對操作人員的加樣要求較嚴格。在樣品制備過程中最好使用反向加樣法，反向加樣法適用于黏稠液體，不但可以保證體積的準確、無氣泡，而且不用打出多余的體積。加樣前拭去槍頭外黏附的多余液體也是提高加樣準確性的方法之一。

綜上所述，本研究根據所使用的流式細胞儀絕對計數原理，建立相應流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞亞群常見問題的處理方案，可以提高檢測結果的準確性。而且由于解決方案簡便可行，適合推廣應用。