流式細(xì)胞儀檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群的常見問題及其解決方案

段萃娟，凌愛琴，張 翠，王瑞玲，宋 娜，王玉飛

淋巴細(xì)胞亞群是構(gòu)成機體免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞群，參與機體細(xì)胞免疫和體液免疫，它可通過流式細(xì)胞儀被檢測，臨床上多用于監(jiān)測腫瘤、感染、移植、過敏患者的免疫狀況。流式細(xì)胞儀(flow cytometer，F(xiàn)CM)集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算機技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)的研究[1-4]。本研究對解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心檢驗科2018年流式細(xì)胞儀日常檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群過程中遇到的常見問題進行分析、總結(jié)，并提出解決方案，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 樣本與儀器設(shè)備 選取2018年檢測的淋巴細(xì)胞亞群樣本14 236例。空腹采集EDTA-K2抗凝靜脈血3 ml。使用邁瑞B(yǎng)riCyteE6流式細(xì)胞儀,試劑均為深圳邁瑞公司產(chǎn)品：四色流式試劑CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC，CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC，F(xiàn)low-Count標(biāo)準(zhǔn)熒光微粒及FACS溶血素(10×)。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞儀質(zhì)控測試 采用Flow-Count標(biāo)準(zhǔn)熒光微粒，通過MRFlow軟件自動完成對儀器的質(zhì)量控制。

1.2.2 樣品制備 取2只檢測管，分別標(biāo)記A和B，A管內(nèi)加入20 μl CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC抗體，B管內(nèi)加入20 μl CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC抗體，然后分別加入50 μl EDTA抗凝靜脈血至管底。試管在旋渦混勻器上輕旋混勻，室溫避光孵育15 min；向試管內(nèi)加入1×溶血素450 μl，在旋渦混勻器上輕旋混勻，室溫避光孵育15 min；待紅細(xì)胞充分裂解后，渦旋混勻，分別上機檢測。

1.2.3 流式分析 應(yīng)用MRFlow軟件自動分析，CD45/SSC散點圖建立P1門選中淋巴細(xì)胞，CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8、CD3/CD19、CD3/CD16+56散點圖建立十字門圈定對應(yīng)區(qū)域的細(xì)胞(以CD3/CD4為例)。A管建立CD45/SSC、CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8散點圖，B管建立CD45/SSC、CD3/CD19、CD3/CD16+56散點圖，從而獲得淋巴細(xì)胞各亞群的絕對計數(shù)和百分比。……