過表達LncRNA H19對糖尿病腎病足細胞生物學行為的影響及相關作用機制

徐靜琳　韓穎敏　孔祥靜　陶海英

[關鍵詞] 糖尿病腎病;自噬;細胞凋亡;細胞增殖;上皮-間質轉化

[中圖分類號] R587.24? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）17-0029-05

Effect of overexpressed LncRNA H19 on the biological behavior of podocytes of patients with diabetic nephropathy and its related mechanism

XU Jinglin1? ?HAN Yingmin1? ?KONG Xiangjing1? ?TAO Haiying2

1.Department of Nephrology，the First People′s Hospital of Taizhou City in Zhejiang Province， Taizhou? ?318020， China; 2.Department of Endocrinology，the First People′s Hospital of Taizhou City in Zhejiang Province， Taizhou? ?318020， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of overexpressed lncRNA H19 on the biological behavior of podocytes in patients with diabetic nephropathy and its related mechanism. Methods Mouse podocyte cell line MPC5 was selected. After the incubation，they were divided into the normal group，high glucose group，silencing group and overexpression group，and the four groups of cells were intervened respectively. MTT assay was used to detect cell proliferation. TUNEL assay was used to detect cell apoptosis. Transwell chamber assay was used to detect cell invasion. The cell wound scratch assay was used to detect cell migration. RT-PCR was used to detect the expressions of lncRNA H19，E-cadherin and vimentin. Western blot was used to detect the relative expressions of apoptosis-related proteins PI3K，Akt，mTOR and autophagy-related proteins Beclin-1， PINK1， Parkin. Results At 24 h，48 h and 72 h，compared with the normal group， the other three groups showed higher rate of the cell proliferation and lower rate of apoptosis. Compared with the high glucose group and silencing group，the proliferation rate of cells in overexpression group was higher and the apoptosis rate was lower （P<0.05）. Compared with the normal group，the other three groups had higher invasion index and migration index in cells. Compared with the high glucose group and silencing group，the overexpression group exhibited lower invasion index and migration index in cells（P<0.05）. Compared with the normal group， the expression of E-cadherin in the other three groups was higher， the expression of lncRNA H19 and vimentin was lower，the relative expression of PI3K，Akt and mTOR was lower，and the relative expression of Beclin-1，PINK1 and Parkin was higher. Compared with the high glucose group and silencing group， the expression of E-cadherin in overexpression group was lower， the expression of LncRNA H19 and vimentin was higher，the relative expression of PI3K，Akt and mTOR was higher，and the relative expression of Beclin-1，PINK1 and Parkin was lower （P<0.05）. Conclusion Overexpressed lncRNA H19 can inhibit the apoptosis of podocytes and promote the proliferation， invasion and migration of podocytes in diabetic nephropathy. The mechanism of action may be that the overexpression of lncRNA H19 can target the regulation of the expressions of apoptosis-related proteins and autophagy-related proteins，thus playing a protective role in podocytes in diabetic nephropathy.

[Key words] Diabetic nephropathy; Autophagy; Cell apoptosis; Cell proliferation; Epithelial-mesenchymal transition

糖尿病腎病是一種臨床常見的糖尿病慢性并發癥，對患者身體健康、生活質量造成嚴重威脅[1-2]。我國人口老齡化現象不斷發展，糖尿病發病率一直居高不下，每年新增糖尿病腎病患者也隨之不斷上升[3-4]。糖尿病腎病患者主要臨床表現為腎功能損傷、蛋白尿。有研究表示，糖尿病腎病患者蛋白尿主要是由于足細胞損傷導致的[5-6]。糖尿病腎病臨床治療難度較高，若病情得不到及時有效的控制，可能會進一步發展為終末期腎病，對患者生命安全造成威脅[7-8]。但目前臨床并無特效的糖尿病腎病治療手段，因此尋找新的糖尿病腎病治療靶點成為目前臨床醫學的研究熱點。本研究設計高糖刺激小鼠足細胞系MPC5實驗，靶向調控LncRNA H19表達，旨在探討調控LncRNA H19表達對糖尿病腎病足細胞的保護作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

①研究細胞：小鼠足細胞系MPC5（上海弘順生物科技有限公司）。②主要試劑：小鼠抗兔LncRNA H19抗體（Hyclone公司）;大鼠抗小鼠E-cadherin、vimentin抗體（Invitrogen公司）;小鼠抗大鼠Beclin-1抗體（Gibco公司）;大鼠抗兔PI3K、Akt抗體（BD公司）;大鼠抗小鼠mTOR抗體（Sigma公司）;兔抗小鼠PINK1、Parkin抗體（Selleck公司）。

1.2 細胞培養及分組處理

取凍存的MPC5細胞，40℃環境中火浴處理，充分搖晃均勻后將其置于2 mL培養基（100 g/L青霉素、鏈霉素及10%胎牛血清）內，進行離心處理，3000 r/min，重懸處理后進行細胞傳代，將細胞培養基置于5%CO2培養箱中培養。將MPC5細胞分為正常組、高糖組、沉默組、過表達組。正常組細胞正常培養，不做其他處理;高糖組、沉默組、過表達組細胞在30 mmol/L葡萄糖培養基中刺激2 d，將各組細胞培養板置于37℃培養箱內培養，培養2周后使用培養基（含1%胎牛血清）培養1 d，重懸處理后分別加入4 μg生理鹽水、pcDNA3.1-LncRNA H19、LncRNA H19-siRNA，電擊后常溫保存2 h，使用培養基培養72 h。

1.3 觀察指標

1.3.1 細胞增殖、凋亡能力檢測? ①MTT法檢測細胞增殖：將各組細胞加入96孔板中，分別于24 h、48 h、72 h后于每孔中加入30 μL的MTT液，37℃孵育4 h，棄培養液，加入150 μL的DMSO，酶標儀在498波長處檢測每孔的OD值。②TUNEL法檢測細胞凋亡：常溫下使用20 μg/mL蛋白酶K培養0.5 h后去除蛋白，清洗后加入100 μL平衡緩沖液，室內平衡10 min，滴入100 μL TdT酶反應液，避光、室溫環境中孵育1 h后加入100 μLSSC溶液，靜置20 min后清洗3次，DAPI復染，避光培養10 min后清洗、封片觀察。DAPI復染細胞核呈藍色，凋亡細胞細胞核呈綠色，取每切片3個視野進行觀察、計算細胞凋亡率，計算平均值。

1.3.2 細胞侵襲、遷移能力檢測? ①Transwell小室實驗檢測細胞侵襲：2 h前濕化小室。上室加入細胞懸液200 μL，在下室加入含10%胎牛血清的細胞培養液，在培養箱中培養24 h。用PBS沖洗2次后置于4%多聚甲醛中30 min，染色后放在顯微鏡下觀察計數，計算侵襲指數。②細胞劃痕實驗檢測細胞遷移：將細胞使用胰酶消化制成細胞懸液，接種于6孔板。使用10槍尖垂直于孔板底部畫直線，PBS緩沖液清洗3次。常溫培養24 h拍照計算遷移指數。

1.3.3 LncRNA H19、EMT相關基因表達檢測? RT-PCR檢測LncRNA H19、E-cadherin、vimentin表達。提取細胞總RNA，檢測RNA純度、含量，逆轉錄處理后獲得cDNA，使用Primer5.0軟件設計引物，采用2-△△Ct方法計算，內參U6，采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的LncRNA H19、E-cadherin、vimentin表達量，LncRNA H19上游引物：5′-TTCAAAGCCTCCACGACTCT-3′，下游引物：5′-GCTCACACTGACGCACACTC-3′。E-cadherin上游引物：5′-ACAGGATGGCTGAAGGTGAC-3′，下游引物：5′-GGATGACA-CAGCGTGAGAGA-3′。vimentin上游引物：5′-GA-CCTCTACGAGGAGGAGAT-3′，下游引物：5′-TTGTCA-ACATCCTGTCTGAA-3′。反應體系：10 μL 2×All-in-One qPCR Mix、1 μL引物正義鏈、2 μL 50×Syner Green、2 μL cDNA、1 μL引物反義鏈、4 μL ddH2O;反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸10 s，共進行30個循環。

1.3.4 細胞凋亡、自噬相關蛋白相對表達量檢測? 使用Western-blot法檢測PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、PINK1、Parkin相對表達量。提取50 μg蛋白，煮沸5 min使蛋白變性后用SDS-PAGE凝膠電泳，然后依據蛋白分子大小將凝膠切開并轉移至PVDF膜上，用Western封閉液把待測蛋白和內參蛋白封閉90 min在室內，按1∶1000加到待測蛋白抗體，內參抗體以1∶2000加入抗體，孵育過夜4℃，使用Western洗滌液洗滌5次，每10分鐘 1次。按1∶5000加入稀釋山羊抗兔IgG，孵育60 min室溫水平搖床，洗滌5次Western洗滌液，每10分鐘 1次。經過ECL顯色和曝光后，進行BIO-RAD成像，使用Image J圖像分析系統檢測條帶的灰度值，以內參條帶灰度值與蛋白比值為結果統計分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;組內不同時間點重復測量進行方差分析，組間對比行獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖率、凋亡率比較

24 h、48 h、72 h時，與正常組細胞比較，其他三組細胞增殖率較低，凋亡率較高，差異有統計學意義（P<0.05）;與高糖組、沉默組細胞比較，過表達組細胞增殖率較高、凋亡率較低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組細胞侵襲、遷移指數比較

與正常組細胞比較，其他三組細胞侵襲指數、遷移指數較高，差異有統計學意義（P<0.05）;與高糖組、沉默組細胞比較，過表達組細胞侵襲指數、遷移指數較低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 各組細胞LncRNA H19、EMT相關基因表達比較

與正常組細胞比較，其他三組細胞E-cadherin表達較高，LncRNA H19、vimentin表達較低，差異有統計學意義（P<0.05）;與高糖組、沉默組細胞比較，過表達組細胞E-cadherin表達較低，LncRNA H19、vimentin表達較高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 各組細胞PI3K/Akt通路蛋白相對表達量比較

與正常組細胞比較，其他三組細胞PI3K、Akt、mTOR相對表達量較低，差異有統計學意義（P<0.05）;與高糖組、沉默組細胞比較，過表達組細胞PI3K、Akt、mTOR相對表達量較高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4、圖1。

2.5 各組細胞自噬相關蛋白相對表達量比較

與正常組細胞比較，其他三組細胞Beclin-1、PINK1、Parkin相對表達量較高，差異有統計學意義（P<0.05）;與高糖組、沉默組細胞比較，過表達組細胞Beclin-1、PINK1、Parkin相對表達量較低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表5、圖2。

3 討論

隨著糖尿病癥狀的發展，會出現一系列的并發癥，其中糖尿病腎病是一種較為常見、嚴重程度較高的慢性糖尿病并發癥[9-10]。糖尿病腎病患者多表現為慢性高血糖、蛋白尿，具有嚴重程度高、病死率高等特點，隨著糖尿病腎病癥狀的不斷發展，患者出現代謝紊亂，嚴重的會發展成為終末期腎病，對患者預后造成嚴重威脅[11-12]。近年來我國糖尿病腎病發病率一直居高不下，且目前尚無一種特效的治療糖尿病腎病的方法，因此越來越多的專家學者開始通過基礎醫學、分子生物學等途徑對糖尿病腎病發病機制、治療靶點進行研究[13-14]。

長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一種內源性RNA，在細胞損傷、凋亡以及多種疾病的發生發展過程中發揮重要作用[15-16]。大量實驗研究表明，LncRNA參與糖尿病腎病的發生發展過程，LncRNA H19是長鏈非編碼RNA家族的重要組成成員。大量研究表明，LncRNA H19表達異常變化參與惡性腫瘤的發生演進，但關于LncRNA H19在糖尿病腎病中作用的研究還鮮有報道[17-18]。有研究表明，隨著糖尿病腎病的發生發展，足細胞會出現一定程度的損傷、凋亡、壞死。有研究表明，LncRNA H19表達與機體慢性腎臟病發生發展具有一定聯系，但關于LncRNA H19表達與糖尿病腎病足細胞損傷的相關性還鮮有報道[19]。本研究結果顯示，高糖刺激后的足細胞增殖率下降、凋亡率、侵襲、遷移指數上升，進行過表達LncRNA H19干預的細胞增殖率上升、凋亡率、侵襲、遷移指數下降，提示糖尿病腎病的發展伴隨著足細胞損傷，過表達LncRNA H19能夠促進足細胞增殖，抑制足細胞凋亡、遷移，從而起到糖尿病腎病足細胞保護作用。

糖尿病腎病患者主要臨床表現為蛋白尿，糖尿病腎病蛋白尿主要是由于足細胞損傷導致的[20]。有研究表示，糖尿病腎病發生發展伴隨著上皮間質轉化（EMT），EMT的發生導致足細胞結構及功能均受到一定程度的損傷，進而導致蛋白尿的發生，因此抑制EMT是減輕糖尿病腎病患者蛋白尿表現的關鍵。E-cadherin、vimentin是較為常用的EMT基因，二者表達變化與EMT密切相關。本研究結果顯示，過表達LncRNA H19干預的足細胞E-cadherin表達下降，vimentin表達上升，提示過表達LncRNA H19能夠靶向調控E-cadherin、vimentin表達，逆轉EMT發生，從而起到減輕糖尿病腎病足細胞損傷的作用。

細胞損傷的發生發展與細胞凋亡、自噬能力具有密切聯系[21-22]。PI3K/Akt信號通路相關蛋白P13K、Akt、mTOR蛋白表達變化與細胞凋亡能力密切相關，靶向調控PI3K/Akt信號通路蛋白表達，能夠對細胞增殖、凋亡能力進行干預。細胞自噬與細胞損傷、凋亡有密切聯系，PINK1/Parkin通路蛋白表達變化與細胞線粒體自噬具有密切聯系，Beclin-1、PINK1、Parkin是細胞自噬標志物，常用于細胞自噬情況的檢測。本研究結果顯示，過表達LncRNA H19干預的足細胞P13K、Akt、mTOR、Beclin-1、PINK1、Parkin表達受到明顯調控，提示過表達LncRNA H19能夠靶向調控PI3K/Akt通路、PINK1/Parkin通路蛋白，抑制糖尿病腎病足細胞自噬、凋亡，從而對糖尿病腎病足細胞起到一定的保護作用。

綜上所述，過表達LncRNA H19表達能夠抑制糖尿病腎病足細胞凋亡，促進糖尿病腎病足細胞增殖、侵襲、遷移，其作用機制可能為過表達LncRNA H19能夠靶向調控細胞凋亡相關蛋白及細胞自噬相關蛋白表達，從而對糖尿病腎病足細胞起到保護作用，為糖尿病腎病的臨床治療提供新的研究靶點及理論依據。

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（收稿日期：2020-12-04）