蘋果組培外植體獲取及培養(yǎng)試驗研究

張秀英，張 丹，馬勉娣，唐 昕，胡志芳，程安富，劉 毅，張孟艷，魯興凱*

（1.昭通市蘋果產業(yè)發(fā)展中心，云南 昭陽 657000；2.鎮(zhèn)雄縣農業(yè)農村局經作辦，云南 鎮(zhèn)雄 657200）

蘋果屬（Malus Mill）是薔薇科（Rosaceae）中一個屬，全世界約有38種，分布于北美洲、亞洲和歐洲等地，具有較高的經濟價值。中國約有30種，其中特有品種為16種[1]，是世界主要栽植果樹品種之一。蘋果組織培養(yǎng)技術不僅可對母本的優(yōu)良性狀進行保持、提純或復壯，而且離體培養(yǎng)下繁殖體個體小、群體大，可控的環(huán)境還能消除季節(jié)因素的限制，從而顯著地提高了繁殖效率，從而成為蘋果植物快速繁殖的一條重要途徑。

植物體中可選擇莖尖、莖段、子葉、胚、原生質體和花藥等作為外植體，通過不同培養(yǎng)途徑獲得再生植株，但不同外植體的再生能力不同，因此，合適外植體的選擇是組織培養(yǎng)成功的前提。目前，利用蘋果外植體進行組織培養(yǎng)的污染率參差不齊，重復性較差，應用效果不佳，有時污染率高達80%，嚴重制約了蘋果組織培養(yǎng)進度。本試驗就組培過程中外植體的獲取方法進行了研究，為蘋果組培苗木繁育技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

盆栽苗：取自昭通主栽品種（秦脆、瑞陽、華碩等）1年生幼苗。其他材料：MS培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂、6-BA、吲哚丁酸（IBA）、聚乙烯醇、升汞（0.1%）、酒精（75%）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 前處理

在早春2—3月，將前1年移栽或嫁接成活的蘋果盆栽苗移入溫室，適應高溫環(huán)境，待萌芽抽枝后，放入人工氣候箱內進行恒溫熱處理。處理溫度調節(jié)在37℃、濕度90%、每天光照12.5 h，光照度為22000 Lx，處理時間35 d。

1.2.2 切取外植體

待人工氣候箱內的盆栽苗萌發(fā)抽生新枝，頂芽或腋芽萌發(fā)長度達到0.5～2 cm時，立即剪取莖尖（葉片較多的莖尖部位要去除多余的葉子，只保留生長點附近1～2片葉）及芽點放入裝有自來水的燒杯中，防止失水枯萎。剪取時要盡量靠近生長點，距離生長點0.5 cm左右為宜。芽點剪取方法見圖1。

圖1 莖尖及芽點切取圖

1.2.3 自來水沖洗

先在裝有外植體的燒杯上方蒙上一層紗布，再在自來水下沖洗30～40 min，去除采集的外植體上的灰塵等。

1.2.4 酒精消毒

將沖洗完畢的外植體拿到超凈工作臺上進行消毒處理，自來水倒掉后，倒入75%酒精，并計時浸泡30 s，隨后用無菌水沖洗2～3遍。

1.2.5 升汞消毒

酒精消毒后外植體放入0.1%升汞中消毒5～7 min，再用無菌水浸洗3～5遍。

1.2.6 分化增殖培養(yǎng)

將升汞消毒后的外植體接種在MS培養(yǎng)基上，附加6-BA 0.8 mg·L-1，IBA 0.2 mg·L-1，蔗糖40 g·L-1，瓊脂6 g·L-1，聚乙烯醇2 g·L-1，pH值6.0[2]。

1.3 指標計算方法

污染率（%）=（真菌或者細菌污染的芽數/供試芽數）×100

成活率（%）=（未死亡的芽數/未被污染的芽數）×100

2 結果與分析

由表1可以看出，通過此方法獲取組培外植體，與常規(guī)獲取組培外植體相比，增加了恒溫熱處理步驟，同時規(guī)定了外植體長度、消毒步驟，利用蘋果在高溫條件下生長出來的莖尖及芽點進行接種培養(yǎng)，使得染菌率低至0%；但剪取的芽點長度直接影響組培苗的成活率，當外植體長度小于0.5 cm時，由于幼嫩芽體耐受性差，芽點褐化嚴重，所以成活率只有35%；當外植體長度在0.5～2 cm時，成活率能達到85%以上，且繁殖能力非常強。分化增殖培養(yǎng)后的芽點生長情況見圖2。

表1 切取的芽點長度對組培苗成活率的影響

圖2 分化增殖培養(yǎng)后的芽點生長情況

3 討論

在植物組織培養(yǎng)中，關于組培方面的報道很多，但利用蘋果外植體進行組織培養(yǎng)的污染率參差不齊，成活率不高，重復性較差，應用效果不佳，有時污染率高達80%，嚴重制約了蘋果組織培養(yǎng)進度，因而如何降低生產成本，簡化工藝，提高繁殖系數和成活率，達到規(guī)模化、商品化生產是組培技術研究的重要方向[3]。陳冉冉等通過剝取蘋果砧木系SH6莖尖培養(yǎng)組培苗，成活率僅為20%[4]。龐曼等通過研究蘋果外植體的消毒方法，污染率最低為48%，成活率最高僅為42%[5]。本實驗研究利用蘋果熱處理脫毒方法，通過規(guī)定所取外植體長度、消毒步驟，顯著降低了利用外植體獲得組培苗的染菌率，低至0%，較之前技術相比提高了75%～92%；同時顯著提高了利用外植體獲得組培苗的成活率，達到85%，且繁殖能力非常強。